Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano usando un lector de microplacas

Resumen

Fuente: Kurokawa, M., et al. Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra la cuantificación de alto rendimiento del crecimiento bacteriano utilizando un lector de microplacas. Describe los pasos implicados en la preparación del cultivo, la medición de la densidad óptica y el análisis de la dinámica del crecimiento.

Protocolo

1. Registro en tiempo real del crecimiento
   1. Dibuja un pictograma de placa de 96 pozos (tabla 8 × 12) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculadas en la placa de 96 pozos. Imprime la tabla y úsala como referencia para el experimento.
      NOTA: Los pozos situados en los bordes de la microplaca solo deben contener medio en blanco debido a la evaporación.
   2. Coloca una microplaca esterilizada de fondo plano de 96 pozos con tapa, puntas de pipeta P-1000 y 1000 μL, P-200 y 200 μL, varios microtubos de 1,5 mL, una pipeta multicanal de 8 módulos, un depósito de reactivos esterilizado, M63 a temperatura ambiente y las culatas de glicerol de Escherichia coli sobre un banco limpio.
   3. Añade aproximadamente 25 mL de M63 al depósito de reactivos. Utiliza este depósito para todos los pasos siguientes.
   4. Añade 900 μL de M63 a los microtubos en preparación para realizar diluciones en serie.
   5. Descongela el stock de glicerol a temperatura ambiente. Añade 900 μL de M63 al glucerol descongelado y al vórtice. Esto resulta en una dilución de 10 veces el stock original de glicerol.
   6. Transfiere 100 μL de la dilución de 10 veces a otro microtubo que contenga 900 μL de M63 y vórtice. Esto resulta en una dilución de 100 veces.
   7. Repite el paso 1.6 hasta alcanzar el número deseado de diluciones.
   8. Rellena los pozos en el borde de la microplaca con 200 μL M63 usando una pipeta de 8 canales (P-200).
      NOTA: Estos pozos pueden usarse como blank.
   9. Carga 200 μL de cada muestra diluida preparada en los pasos 1.4 - 1.7 a los pozos de microplacas según la tabla de referencia (paso 1.1). Vierte las muestras diluidas antes de cargarlas y carga la misma muestra en varios pozos en diferentes ubicaciones de la placa.
   10. Coloca la microplaca de 96 pozos en el lector de placas.
   11. Abre "Leer ahora" en el "Administrador de tareas" y elige el programa. Haz clic en "OK" para empezar a medir. Guarda la grabación como un nuevo archivo experimental para el análisis de datos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fosfato de dipotasio	Wako	164-04295
Fosfato monopotásico	Wako	166-04255
Sulfato de amonio	Wako	019-03435
Sulfato de magnesio heptahidratado	Wako	138-00415
Tiamina-HCl	Wako	201-00852
Glucosa	Wako	049-31165
Hcl	Wako	080-01066
Hierro (II) sulfato heptahidrato	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Glicerol	Wako	075-00611
Puntas de pipeta, 200 μL	WATSON	110-705Y
Puntas de pipeta, 1.000 μL	WATSON	110-8040
Microtubo (1,5 mL)	WATSON	131-715C
8 pipetas multicanal	WATSON	NT-8200
Agitador Pasorina	COMO UNO	2-4990-02
Cilindro de vidrio (200 mL)	COMO UNO	1-8562-07
Medidor de pH de precisión	COMO UNO	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Soporte para microtubos	BM Bio	801-02Y
Vórtice	BM Bio	BM-V1
Microplaca Corning Costar de 96 pozos con tapa (Fondo plano, transparente)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Reservorio de reactivos Corning Costar (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
Banco limpio BIO	Panasonic	MCV-B131F
Cepas bacterianas	Organización de bancos de cepa; Proyecto Nacional de Recursos Biológicos (NBRP) en Japón