Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano usando un lector de microplacas

Abstract

Fuente: Kurokawa, M., et al. Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra la cuantificación de alto rendimiento del crecimiento bacteriano utilizando un lector de microplacas. Describe los pasos implicados en la preparación del cultivo, la medición de la densidad óptica y el análisis de la dinámica del crecimiento.

Protocol

1. Registro en tiempo real del crecimiento
   1. Dibuja un pictograma de placa de 96 pozos (tabla 8 × 12) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculadas en la placa de 96 pozos. Imprime la tabla y úsala como referencia para el experimento.
      NOTA: Los pozos situados en los bordes de la microplaca solo deben contener medio en blanco debido a la evaporación.
   2. Coloca una microplaca esterilizada de fondo plano de 96 pozos con tapa, puntas de pipeta P-1000 y 1000 μL, P-200 y 200 μL, varios microtubos de 1,5 mL, una pipeta multicanal de 8 módulos, un depósito de reactivos esterilizado, M63 a temperatura ambiente y las culatas de glicerol de Escherichia coli sobre un banco limpio.
   3. Añade aproximadamente 25 mL de M63 al depósito de reactivos. Utiliza este depósito para todos los pasos siguientes.
   4. Añade 900 μL de M63 a los microtubos en preparación para realizar diluciones en serie.
   5. Descongela el stock de glicerol a temperatura ambiente. Añade 900 μL de M63 al glucerol descongelado y al vórtice. Esto resulta en una dilución de 10 veces el stock original de glicerol.
   6. Transfiere 100 μL de la dilución de 10 veces a otro microtubo que contenga 900 μL de M63 y vórtice. Esto resulta en una dilución de 100 veces.
   7. Repite el paso 1.6 hasta alcanzar el número deseado de diluciones.
   8. Rellena los pozos en el borde de la microplaca con 200 μL M63 usando una pipeta de 8 canales (P-200).
      NOTA: Estos pozos pueden usarse como blank.
   9. Carga 200 μL de cada muestra diluida preparada en los pasos 1.4 - 1.7 a los pozos de microplacas según la tabla de referencia (paso 1.1). Vierte las muestras diluidas antes de cargarlas y carga la misma muestra en varios pozos en diferentes ubicaciones de la placa.
   10. Coloca la microplaca de 96 pozos en el lector de placas.
   11. Abre "Leer ahora" en el "Administrador de tareas" y elige el programa. Haz clic en "OK" para empezar a medir. Guarda la grabación como un nuevo archivo experimental para el análisis de datos.

Materials