Evaluación de la actividad bacteriana de chaperona mediante el despliegue térmico de una proteína modelo

Resumen

Fuente: Dahl, J. et al. Detección de la actividad dependiente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra un ensayo basado en un espectrofotómetro de fluorescencia para evaluar la actividad de chaperonas en una proteína sustrato sometida a estrés ácido y térmico. Describe los pasos para monitorizar el despliegue y la agregación del sustrato mediante dispersión de luz, comparando las condiciones con y sin el acompañante.

Protocolo

1. Ensayo de actividad de chaperona utilizando deshidrogenasa de malato (MDH) de despliegue térmico

NOTA: Se monitorizó la influencia del HdeB purificado en la agregación de deshidrogenasa mitocondrial mitocondrial (MDH) porcina que se despliega térmicamente a diferentes valores de pH, como se describe a continuación. Todas las concentraciones de proteínas listadas se refieren a la concentración de monómeros.

1. Para preparar MDH, diálisa MDH a 4 °C durante la noche frente a 4 L de tampón C (50 mM fosfato potásico, 50 mM cloruro de sodio (NaCl), pH 7,5) y concentra la proteína a aproximadamente 100 μM utilizando filtros centrífugos con un corte de peso molecular de 30 kDa.
   NOTA: Se requiere una diálisis cuidadosa del MDH, ya que el MDH se administra en solución de sulfato de amonio.
2. Para eliminar agregados, centrifugar la proteína durante 20 minutos a 20.000 x g a 4 °C. Determinar la concentración de MDH mediante la absorbancia a 280 nm (ε_{280 nm} = 7.950 ^{M-1 cm-1}). Preparar 50 μl de alicotas de MDH y congelar rápidamente las alicuotas para su almacenamiento.
3. Coloque una cubetas de cuarzo de 1 ml en un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con portamuestras y agitadores controlados por temperatura. Ajusta λ_ex/em a 350 nm.
4. Añadir los volúmenes apropiados de amortiguador D precalentado (43 °C) (150 mM fosfato potásico, 150 mM NaCl) a los valores de pH deseados (aquí: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 y pH 5,0) a la cubeta, y ajusta la temperatura en el soporte de la cubetas a 43 °C. El volumen total es de 1.000 μl.
5. Añadir 12,5 μM de HdeB (o alternativamente, el mismo volumen de búfer de almacenamiento HdeB para el control del búfer) al búfer, seguido de la adición de 0,5 μM MDH. Empieza a monitorizar la dispersión de la luz. Incubar la reacción durante 360 segundos para permitir un desarrollo suficiente de MDH.
6. Sube el pH a 7 añadiendo un volumen de 0,16-0,34 de 2 M sin búfer_{K 2}HPO₄ y continúa registrando la dispersión de luz durante otros 440 segundos.
7. Ajusta el grado de agregación de MDH registrado en ausencia del chaperón en un momento definido tras la neutralización (en adelante 500 segundos, cuando se observó la máxima dispersión de luz de MDH) al 100%. Normalizar la actividad de HdeB a la señal de dispersión de luz de MDH en ausencia de HdeB en cada valor de pH indicado.

Materiales