Evaluación de la actividad bacteriana de chaperona mediante el despliegue térmico de una proteína modelo

Resumen

Fuente: Dahl, J. et al. Detección de la actividad dependiente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra un ensayo basado en un espectrofotómetro de fluorescencia para evaluar la actividad de chaperonas en una proteína sustrato sometida a estrés ácido y térmico. Describe los pasos para monitorizar el despliegue y la agregación del sustrato mediante dispersión de luz, comparando las condiciones con y sin el acompañante.

Protocolo

1. Ensayo de actividad de chaperona utilizando deshidrogenasa de malato (MDH) de despliegue térmico

NOTA: Se monitorizó la influencia del HdeB purificado en la agregación de deshidrogenasa mitocondrial mitocondrial (MDH) porcina que se despliega térmicamente a diferentes valores de pH, como se describe a continuación. Todas las concentraciones de proteínas listadas se refieren a la concentración de monómeros.

1. Para preparar MDH, diálisa MDH a 4 °C durante la noche frente a 4 L de tampón C (50 mM fosfato potásico, 50 mM cloruro de sodio (NaCl), pH 7,5) y concentra la proteína a aproximadamente 100 μM utiliza....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Deshidrogenasa de malato (MDH)	Roche	10127914001
Fosfato de potasio (monobásico)	Fisher Scientific	BP362-500
Fosfato de potasio (dibásico)	Fisher Scientific	BP363-1
Espectrofotómetro de fluorescencia F-4500	Hitachi	FL25
Cuveta de celda de fluorescencia	Hellma Analytics	119004F-10-40
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144-212
Hidróxido sódico	Fisher Scientific	BP359-500
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra 30K	Millipore	UFC803024
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-10
MWCO de membrana diálisis Spectra/Por 1: 6 kDa	Laboratorios Spectrum	132650
Espectrofotómetro Varian Cary 50	Agilent Tech