Evaluación del papel protector de una chaperona activada por ácido en E. coli bajo estrés ácido

Resumen

Fuente: Dahl, J., et al. Detección de la actividad dependiente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra el uso de cultivos recombinantes de E. coli para evaluar el efecto protector de una chaperona activada por ácido durante el estrés ácido. El monitoreo del crecimiento bacteriano revela una mayor supervivencia en cultivos que expresan chaperones en comparación con los controles, lo que pone de manifiesto el papel de las chaperonas en la estabilización de proteínas bajo condiciones de estrés.

Protocolo

1. Efecto de la sobreexpresión de la chaperona HdeB en la supervivencia de E. coli bajo estrés ácido

NOTA: El ADN genómico de E. coli MG1655 fue aislado usando el protocolo estándar.

1. Amplificar chaperona hdeB de E. coli MG1655 mediante PCR usando cebadores hdeB-BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT y hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG ATG ATT TCA TCT CTC CTC C.
2. Preparar la reacción PCR en 50 μl de la siguiente manera: 10 μl de 5x tampón de polimerasa, 200 μM dNTPs, cebador JUD2 de 0,5 μM, cebador JUD5 de 0,5 μM, 150 ng de ADN genómico MG1655, 0,5 μl de ADN polimerasa, añadir_{ddH 2}O a 50 μl.
3. Realizar la amplificación de hdeB de la siguiente manera: Paso 1: 5 minutos a 95 °C, 1 ciclo; paso 2: 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, 30 segundos a 72 °C, 40 ciclos; Paso 3: 10 minutos a 72 °C.
4. Clonar el fragmento de PCR resultante en los sitios EcoRI y BamHI del plásmido pBAD18 utilizando métodos estándar para la clonación de sitios de restricción. Purifica el plásmido usando un kit de purificación de plásmidos según las instrucciones del fabricante. Verifica el plásmido resultante mediante secuenciación.
5. Transformar el plásmido que expresa HdeB o el control del vector vacío pBAD18 en la cepa BB7224 (ΔrpoH) (genotipo: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) utilizando células químicamente competentes.
   NOTA: Esta cepa es sensible a la temperatura.
6. Tras un choque térmico de 45 segundos a 42 °C y antes del blindaje, incubar las células a 30 °C y 200 rpm. Realizar estrías en colonia única de los clones positivos e incubar durante la noche a 30 °C. Preparar un cultivo nocturno en 50 ml LB_amp y cultivar las células a 200 rpm y 30 °C.
7. Diluir cultivos nocturnos 40 veces en 25 ml LB_Amp y cultivar la bacteria en presencia de 0,5% de arabinosa (Ara) a 30 °C y 200 rpm hasta una _O.D.600nm = 1,0 para inducir la expresión de la proteína HdeB.
8. Para los experimentos de cambio de pH, se utiliza LB_Amp+Ara para diluir las células a una OD _{de 600nm} de 0,5 y ajusta a los valores de pH respectivos (aquí: pH 2.0, pH 3.0 y pH 4.0) añadiendo volúmenes apropiados de 5 M HCl.
9. Tras los puntos de tiempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutraliza los cultivos añadiendo los volúmenes apropiados de 5 M de NaOH.
10. Monitoriza el crecimiento de los cultivos neutralizados en cultivo líquido durante 12 horas a 30 °C utilizando mediciones de sobredosis.

Materiales