Extracción de ADN genómico basado en lisis térmica de una bacteria patógena

Resumen

Fuente: Gulla, S., et al. Análisis tándem-repetición multilocus de la bacteria patogénica de peces Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019).

Este protocolo extrae ADN genómico de Yersinia ruckeri suspendiendo colonias aisladas en agua ultrapura y aplicando calor para lisar las células. La centrifugación separa el sobrenadante que contiene ADN de los restos celulares, produciendo ADN plantilla adecuado para la genotipificación basada en PCR y el análisis epidemiológico.

Protocolo

1. Cultivo bacteriano y extracción de ADN genómico

1. Siembra cultivos puros de Y. ruckeri en cualquier tipo de agar adecuado (los autores usaron agar de sangre bovina al 5%) e incuba a 22 °C durante 1-2 días, o a 15 °C durante 3-4 días.
2. De cada placa de agar, se toma una colonia representativa con un lazo de inoculación y transfírela a tubos centrífugos de 1,5 mL que contienen 50 μL de agua ultrapurificada. Suspende, pon un vórtice brevemente e incuba durante 7 minutos en un bloque calefactor a 100 °C.
3. Centrifuga a 16.000 x g durante 3 minutos y utiliza una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga vacío de 1,5 mL. Proceder al siguiente paso usando el sobrenadante como ADN plantilla o almacenarlo a -20 °C hasta ese momento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora de 22°C/15°C	Como prefieras.	NA
Centrifugadora(s)	Como prefieras.	NA
Tubos de bloqueo de caja fuerte Eppendorf, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Tubos de centrifugación usados durante la extracción de ADN.
Congelador	Como prefieras.	NA
Bloque calefactor	Como prefieras.	NA
Agua Milli-Q	NA	NA	Agua purificada utilizada durante la PCR y la electroforesis capilar. Receta estándar; producido internamente.
Cultura pura de la ruckeri de Yersinia	NA	NA	Por ejemplo, criopreservado o fresco.
Vórtice	Como prefieras.	NA