Detección de patógenos de peces mediante análisis de repetición en tándem de número variable (VNTR)

Abstract

Fuente: Gulla, S., et al. Análisis tándem-repetición multilocus de la bacteria patogénica de peces Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo muestra el procedimiento para separar amplicones de repetición en tándem de número variable marcados con fluorescencia (VNTR), derivados de una bacteria patogénica de peces, utilizando electroforesis capilar para generar perfiles electroferográficos específicos por tamaño para la identificación bacteriana.

Protocol

1. Configuración y condiciones de funcionamiento de la electroforesis capilar

1. Tras la confirmación de amplicones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), se diluyen los productos de PCR 1:10 (v/v) en agua purificada. Sellar, mezclar y centrifugar brevemente.
2. Trabajando en una armaria de humos, preparar un volumen de mezcla maestra compuesto por 9 μL de formamida y 0,5 μL de tamaño estándar por producto PCR (permitir un 10% de volumen excedente). Distribuir brevemente 9,5 μL en pozos en una placa adecuada para el sistema CE (electroforesis capilar) disponible, antes de añadir 0,5 μL de producto PCR diluido. Sellar, mezclar y centrifugar brevemente.
   CAUTELA: Maneja con cuidado. Mezclar formamida con agua genera ácido fórmico, que es tóxico.
3. Utilizando un ciclador térmico de PCR, desnaturaliza las muestras a 95 °C durante 3 minutos antes de enfriar a 4 °C indefinidamente. Centrifuga brevemente y carga la placa en un sistema CE calibrado según las instrucciones del fabricante.
4. Realizar análisis de fragmentos CE usando reactivos según corresponda al aparato elegido y los siguientes ajustes: 60 °C; 5 s inyecciones a 1,6 kV (32 V por cm); 32 minutos de autonomía a 15 kV (300 V por cm). El análisis de fragmentos CE de 24 pozos en un 24-capilares (50 cm) suele durar aproximadamente 50 minutos.

Materials