Exponer una comunidad bacteriana oral sintética a fases simuladas de digestión

Resumen

Fuente: Arroyo, M. C., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demuestra la evaluación de la viabilidad de una comunidad microbiana oral sintética durante la digestión simulada oral, gástrica e intestinal. La supervivencia bacteriana se cuantifica tras cada fase, lo que revela un declive progresivo debido al estrés digestivo.

Protocolo

1. Supervivencia bacteriana tras condiciones de tránsito gastrointestinal in vitro

NOTA: Prepara fluidos de digestión simulados con las modificaciones descritas a continuación. Prepara todas las diluciones con agua ultrapura. Filtrar todas las soluciones mediante un filtro de 0,22 μm y realizar el procedimiento de digestión en condiciones estériles.

1. Digestión oral:
   1. Colocar 3 mL de la comunidad bacteriana en un tubo estéril de 50 mL, mezclar con 3 mL de fluido salival simulado (SSF), que contenga en milimoles por litro (mmol L⁻¹): cloruro de potasio (KCl), 15,1; Fosfato monopotásico (KH₂PO₄), 3,7; Bicarbonato de sodio (NaHCO₃), 6,8; Cloruro de magnesio hexahidrato (MgCl₂·6H₂O), 0,5, carbonato de amonio [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Ácido clorhídrico (HCl), 1.1; Cloruro de calcio dihidrato (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Añade 75 U/mL de α-amilasa de saliva humana tipo IX-A y 2 g/L de mucina del estómago porcino (tipo II) al SSF.
   2. Incuba la mezcla durante 2 minutos a 37 °C y 100 rpm. Recoger una muestra de 2 mL para extracción de ADN y cuantificación por citometría de flujo (S1).

2. Digestión gástrica:

1. Añadir 4 mL de líquido gástrico simulado (SGF), que contiene (en mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Cloruro de sodio (NaCl), 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Además, el SGF contenía 2 g/L de mucina del estómago porcino (Tipo II).
2. Mide el pH y ajusta a pH 3 con 1 molar (1 M) de HCl, si es necesario. Incubar a 37 °C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S2).

3. Digestión del intestino delgado:

1. Añadir 4 mL de líquido intestinal simulado (SIF) que contiene (en mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, al tubo digestivo.
2. Ajusta a pH 7 con 1 M de hidróxido de sodio (NaOH), si es necesario. Incubar a 37 °C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S3).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mucina del estómago porcino tipo II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q academic, sistema de agua ultra pura	Millipore, Merck KGaA	-
Incubadora InnOva 4080	Científica de Nuevo Brunswick	8261-30-1007
Agua libre de nucleasas	Electroforesis Serva	28539010
Citómetro de flujo BD Accuri C6	BD Biociencias	653118
Kit InnuPREP PCRpure	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purificación PCR