Extracción de ADN genómico de tejido foliar vegetal infectado con bacterias patógenas

Resumen

Fuente: Gulla, S., et al. Análisis tándem-repetición multilocus de la bacteria patogénica de peces Yersinia ruckeri mediante PCR multiplex y electroforesis capilar. J. Vis. Exp. (2019).

Este protocolo extrae ADN genómico de Yersinia ruckeri suspendiendo colonias aisladas en agua ultrapura y aplicando calor para lisar las células. La centrifugación separa el sobrenadante que contiene ADN de los restos celulares, produciendo ADN plantilla adecuado para la genotipificación basada en PCR y el análisis epidemiológico.

Protocolo

1. Cultivo bacteriano y extracción de ADN genómico

1. Siembra cultivos puros de Y. ruckeri en cualquier tipo de agar adecuado (los autores usaron agar de sangre bovina al 5%) e incuba a 22 °C durante 1-2 días, o a 15 °C durante 3-4 días.
2. De cada placa de agar, se toma una colonia representativa con un lazo de inoculación y transfírela a tubos centrífugos de 1,5 mL que contienen 50 μL de agua ultrapurificada. Suspende, pon un vórtice brevemente e incuba durante 7 minutos en un bloque calefactor a 100 °C.
3. Centrifuga a 16.000 x g durante 3 minutos y utiliza una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga vacío de 1,5 mL. Proceder al siguiente paso usando el sobrenadante como ADN plantilla o almacenarlo a -20 °C hasta ese momento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard	Promega	A1120	Fuente de la lisis de núcleos, RNasa, precipitación de proteínas y soluciones de rehidratación de ADN
Nitrógeno líquido	Productos de aire	N/A
Mastercycler Pro con panel de control	Eppendorf	6321000019
Microondas de 1250 W	Panasonic	N/A
Centrífuga de mesa 5424	Eppendorf	05-403-93
Baños maria digitales Isotemp 215	Fisher Scientific	15-462-15Q
Espátula metálica	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortero y mano	Sigma-Aldrich	Z247464
Mezclador de vórtices LSE	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Puntas estériles de 10 μL	Consejo Uno	1161-3730
Puntas estériles de 200 μL	Consejo Uno	1163-1730
Puntas estériles de 1250 μL	Consejo Uno	1161-1750
Kit de Pipettores de Volumen Variable	VWR	75788-460
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E1510
Agarosa	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Ácido acético	Fisher Chemical	A38-212
Base de Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
Μcuvette	Eppendorf	6138000018
Bioespectrómetro básico	Eppendorf	6135000009