1. Preparación de superposición y pruebas de supernadantes para la actividad<ol><li>Inocular una sola colonia de una cepa de P. syringae para evaluar la sensibilidad en 3 ml de KB (King's medium B), incubar durante la noche con agitación a temperatura ambiente.</li><li>A la mañana siguiente, diluye el cultivo 1/100 hasta convertirlo en KB fresco. Incuba 3-4 horas agitando a temperatura ambiente.</li><li>Prepara ágar de agua esterilizado autoclavando una suspensión de 0,35-0,7% (p/v) de agar en agua ultrapura. NOTA: Un stock de agar de agua blanda puede fundirse en un microondas y reutilizarse repetidamente; No es necesario preparar una nueva superposición para cada experimento. Si se reutiliza agar acuático, es fundamental asegurarse de que se derrite completamente tras el microondas. Si no, la superposición tendrá una textura granulada al solidificarse, lo que dificultará la interpretación.</li><li>Antes de su uso, mantén el agar blando fundido en un baño maría a 60 °C. Utilizando una pipeta sorológica estéril, transfiere 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Devuelve el tubo de cultivo al baño maria para mantener el estado fundido.</li><li>Para verter la capa de recubrimiento, primero deja que el agar fundido se enfríe (debe sentirse caliente pero no caliente al tacto), pero no dejes que se solidifique.</li><li>En una capucha estéril, inocular 100 μl del cultivo de cepa en el agar blando y el vórtice para mezclar. Gira el cultivo a mano durante 10-15 segundos y luego vierte sobre un agar de fondo (agar KB). Inclina la placa en todas las direcciones para asegurarte de que el agar blando cubra uniformemente el agar inferior. NOTA: El agar inferior puede ser cualquier medio solidificado (1,5% agar) sobre el que la cepa de prueba crezca vigorosamente. Para una placa de Petri estándar de 100 mm de diámetro, usa ~20 ml de medio fundido. El agar de fondo puede prepararse varias semanas antes (si se mantiene a 4 °C sin secarse) o puede prepararse el mismo día.</li><li>Cubre el plato y déjalo solidificar durante 20-30 minutos. Ten cuidado de no molestar la placa mientras se solidifica.</li><li>Una vez solidificado, coloca entre 2 y 5 μl de sobrenadante sobre la capa de cobertura. Deja que las placas incuben durante la noche a temperatura ambiente. Observa y registra los resultados a la mañana siguiente. NOTA: Puede ser útil realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre la actividad de eliminación de bacteriófagos y la de bacteriocina. En este caso, se recomienda realizar diluciones 1:5 o 1:10.</li></ol>

<figure class='table'><table class='ck-table-resized'><colgroup><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'></colgroup><tbody><tr><td>Mitomicina C</td><td>Santa Cruz Biotecnología</td><td>SC-3514</td><td>Cancerígeno. Utiliza el EPI adecuado (es decir, guantes, protección para los ojos y mascarilla), especialmente al preparar la solución de serie.</td></tr><tr><td>Agar de grado bacteriológico</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td> </td></tr></tbody></table></figure>

ensayo de superposición de agar blando para detectar la muerte mediada por bacteriocina en pseudomonas syringae

Soft Agar Overlay Assay for Detecting Bacteriocin-Mediated Killing in Pseudomonas syringae

Fuente: <a href='https://app.jove.com/v/55064/use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced'>Hockett, K. L. y Baltrus, D. A. Uso de la técnica de superposición de agar blando para detectar compuestos inhibidores producidos por bacterias. J. Vis. Exp. (2017)</a>Este vídeo muestra el procedimiento para detectar la muerte mediada por bacteriocina detectando sobrenadante de una cepa donante inducida por antibióticos sobre una capa de agar blando que contiene una cepa de prueba. Las zonas claras formadas tras la incubación indican inhibición bacteriana.

Ensayo de superposición de agar blando para detectar la muerte mediada por bacteriocina en Pseudomonas syringae

Source: Hockett, K. L., and Baltrus, D. A. Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds. J. Vis. Exp. ...

Comienza con un agar blando fundido y mantenido a una temperatura cálida.Inocúla un cultivo de Pseudomonas syringae , la cepa de prueba, en el agar.Luego haz un vórtice breve para distribuir las células de forma uniforme.Vierte la mezcla sobre una placa de agar solidificada y extiéndela uniformemente.Cierra la tapa y deja que se solidifique.Localiza un sobrenadante filtrado en la superficie del agar solidificado.El sobrenadante contiene bacteriocina, una molécula antibacteriana derivada de una cepa de donante inducida por estrés, P. syringae .Incuba la placa para permitir el crecimiento bacteriano y la difusión de la bacteriocina a través del agar.La bacteriocina se une a receptores superficiales específicos de la cepa de prueba y altera su membrana, lo que conduce a la muerte celular.Esto da lugar a la formación de una zona clara en el agar, indicando la zona donde la cepa de prueba ha sido eliminada por la molécula antibacteriana bacteriocina.Diluye el cultivo de 1 a 100 KB frescos. Incuba el cultivo durante tres o cuatro horas agitándolo a temperatura ambiente. A continuación, prepara agar de agua esterilizado autoclavando una suspensión de agar en agua ultrapura.Mantenga el agar blando fundido en un baño maria a 60 grados Celsius antes de su uso. Utilizando una pipeta sorológica estéril, transfiere tres mililitros de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Devuelve el tubo de cultivo al baño maria para mantenerlo en estado fundido.Antes de verter la capa de recubrimiento, deja que el agar fundido se enfríe, pero no dejes que se solidifique.Es fundamental que el agar se mantenga en un estado caliente y completamente fundido antes de la inoculación. Si no, la superposición tendrá un aspecto granulado y será más difícil de interpretar.En una capucha estéril, inocular 100 microlitros del cultivo de cepa en el agar blando y el vórtice para mezclar. Gira el cultivo a mano durante 10 a 15 segundos y luego viertelo sobre la parte inferior de una placa de ágar. Inclina la placa en todas las direcciones para asegurarte de que el agar blando cubra uniformemente el agar inferior.Cubre el plato y déjalo solidificar entre 20 y 30 minutos. Ten cuidado de no alterar la placa mientras solidifica. Una vez solidificado, coloca entre dos y cinco microlitros de sobrenadante sobre la capa de protección.Deja que las placas incuben durante la noche a temperatura ambiente. Observa y registra los resultados a la mañana siguiente. Con este método, dos cepas de P. syringae son inhibidas por diferentes bacteriocinas. La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular, la tailocina, pero no sensible a una bacteriacina alternativa de bajo peso molecular.

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Crecimiento bacteriano y técnicas

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Ensayos y métodos de detección

554 vistas. Comienza con un agar blando fundido y mantenido a una temperatura cálida.Inocúla un cultivo de Pseudomonas syringae , la cepa de prueba, en el agar.Luego haz un vórtice breve para distribuir las células de forma uniforme.Vierte la mezcla sobre una placa de agar solidificada y extiéndela uniformemente.Cierra la tapa y deja que se solidifique.Localiza un sobrenadante filtrado en la superficie del agar solidificado.El sobrenadante contiene ba...

Ensayo de superposición de agar blando para detectar la muerte mediada por bacteriocina en Pseudomonas syringae

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Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mitomicina C	Santa Cruz Biotecnología	SC-3514	Cancerígeno. Utiliza el EPI adecuado (es decir, guantes, protección para los ojos y mascarilla), especialmente al preparar la solución de serie.
Agar de grado bacteriológico	Genesee Scientific	20-274