Ensayo de superposición de agar blando para detectar la muerte mediada por bacteriocina en Pseudomonas syringae

Resumen

Fuente: Hockett, K. L. y Baltrus, D. A. Uso de la técnica de superposición de agar blando para detectar compuestos inhibidores producidos por bacterias. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo muestra el procedimiento para detectar la muerte mediada por bacteriocina detectando sobrenadante de una cepa donante inducida por antibióticos sobre una capa de agar blando que contiene una cepa de prueba. Las zonas claras formadas tras la incubación indican inhibición bacteriana.

Protocolo

1. Preparación de superposición y pruebas de supernadantes para la actividad

1. Inocular una sola colonia de una cepa de P. syringae para evaluar la sensibilidad en 3 ml de KB (King's medium B), incubar durante la noche con agitación a temperatura ambiente.
2. A la mañana siguiente, diluye el cultivo 1/100 hasta convertirlo en KB fresco. Incuba 3-4 horas agitando a temperatura ambiente.
3. Prepara ágar de agua esterilizado autoclavando una suspensión de 0,35-0,7% (p/v) de agar en agua ultrapura.
   NOTA: Un stock de agar de agua blanda puede fundirse en un microondas y reutilizarse repetidamente; No es necesario preparar una nueva superposición para cada experimento. Si se reutiliza agar acuático, es fundamental asegurarse de que se derrite completamente tras el microondas. Si no, la superposición tendrá una textura granulada al solidificarse, lo que dificultará la interpretación.
4. Antes de su uso, mantén el agar blando fundido en un baño maría a 60 °C. Utilizando una pipeta sorológica estéril, transfiere 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Devuelve el tubo de cultivo al baño maria para mantener el estado fundido.
5. Para verter la capa de recubrimiento, primero deja que el agar fundido se enfríe (debe sentirse caliente pero no caliente al tacto), pero no dejes que se solidifique.
6. En una capucha estéril, inocular 100 μl del cultivo de cepa en el agar blando y el vórtice para mezclar. Gira el cultivo a mano durante 10-15 segundos y luego vierte sobre un agar de fondo (agar KB). Inclina la placa en todas las direcciones para asegurarte de que el agar blando cubra uniformemente el agar inferior.
   NOTA: El agar inferior puede ser cualquier medio solidificado (1,5% agar) sobre el que la cepa de prueba crezca vigorosamente. Para una placa de Petri estándar de 100 mm de diámetro, usa ~20 ml de medio fundido. El agar de fondo puede prepararse varias semanas antes (si se mantiene a 4 °C sin secarse) o puede prepararse el mismo día.
7. Cubre el plato y déjalo solidificar durante 20-30 minutos. Ten cuidado de no molestar la placa mientras se solidifica.
8. Una vez solidificado, coloca entre 2 y 5 μl de sobrenadante sobre la capa de cobertura. Deja que las placas incuben durante la noche a temperatura ambiente. Observa y registra los resultados a la mañana siguiente.
   NOTA: Puede ser útil realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre la actividad de eliminación de bacteriófagos y la de bacteriocina. En este caso, se recomienda realizar diluciones 1:5 o 1:10.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mitomicina C	Santa Cruz Biotecnología	SC-3514	Cancerígeno. Utiliza el EPI adecuado (es decir, guantes, protección para los ojos y mascarilla), especialmente al preparar la solución de serie.
Agar de grado bacteriológico	Genesee Scientific	20-274