Aislamiento de bacterias adaptadas al estrés mediante selección de colonia única

Resumen

Fuente: Jeong, H., et al. Procedimiento para la evolución adaptativa en laboratorio de microorganismos utilizando un quimiostato. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demuestra el aislamiento selectivo y el crecimiento de bacterias adaptadas al estrés a partir de un cultivo expuesto a condiciones prolongadas de estrés. El cultivo se coloca sobre agar que contiene un factor de estrés, y se selecciona una sola colonia para inocular un medio líquido con el factor de estrés. La absorbancia se mide a intervalos regulares para monitorizar el crecimiento y confirmar el aislamiento exitoso de las bacterias adaptadas al estrés.

Protocolo

1. Preparación del equipo

1. Consigue un tarro de quimostato (150-250 ml) o un frasco Erlenmeyer (250 ml) que contenga un puerto de entrada y un puerto de salida. Conecta los puertos con tubería de silicio, permitiendo caudales de 10-100 ml/h. Opcionalmente, utiliza una rejilla de aire, una salida de aire y entradas y salidas de agua con control de temperatura.
2. Consigue un dispositivo adecuado para el tarro de quimostato que permita agitación y control de temperatura (o utiliza una incubadora rotativa de agitación).
3. Consigue dos bombas peristálticas para suministrar el medio fresco y recoger el cultivo.
4. Consigue un tarro depósito (10-20 L) que contenga un puerto de salida medio y un puerto de entrada de aire.
5. Obtener tubería de silicio adecuada para la tasa de dilución (es decir, diámetro interior 0,8 mm, rango de flujo 0,06-36 ml/min; L/S 13 tubing).

2. Preparación y esterilización del medio

1. Medio inicial
   1. Disuelva 0,3 g de glucosa, 0,08 g de cloruro de amonio (NH₄Cl), 0,05 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,75 g de fosfato de hidrógeno disódico dihidrato (Na₂HPO 4,2H₂O) y 0,3 g de dihidrato de fosfato de hidrógeno dissódico (KH₂PO₄) en 90 mL de agua destilada (D.W.) en un frasco de quimostó.
   2. Sella el tarro del quimostato junto con el tubo usando abrazaderas. No selles la rejilla de ventilación.
   3. Esteriliza el tarro del quimostato en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Tras la esterilización, guarda el tarro de quimostato a temperatura ambiente.
   4. Disolver 0,02 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO_{4,7H 2}O), 0,01 g de cloruro de calcio (CaCl₂) y 0,1 mg de tiamina en 10 mL de difusión (solución A).
   5. Filtrar la solución A usando una jeringuilla y un filtro de jeringuilla preesterilizado (un filtro de poros de 0,45 μm).
   6. Añade el filtrado de solución A al tarro de quimostó.
2. Medio de tensión
   1. Disolver 30 g de glucosa, 8 g de NH₄Cl, 5 g de NaCl, 75 g de_{Na 2}HPO₄·2H₂O, 30 g de_{KH 2}PO₄ y 300 g de succinato disódico hexahidrato (Na₂·succinato·6H₂O; el factor estresante utilizado en este experimento) en 9,9 L D.W. en un tarro reservorio.
   2. Sella el tarro del depósito junto con el tubo usando abrazaderas. No selles la rejilla de ventilación.
   3. Esteriliza el tarro del depósito en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Después de la esterilización, guarda el tarro a temperatura ambiente.
   4. Disolver 2 g de MgSO 4,7H ₂O, 1 g de_{CaCl 2} y 10 mg de tiamina en 100 ml de D.W. (solución A).
   5. Filtra la solución A con una jeringuilla y un filtro de jeringuilla preesterilizado (un filtro de poros de 0,45 μm).
   6. Añade el filtrado de solución A al tarro del depósito.
   7. Conecta asépticamente el tubo de silicio esterilizado al tarro del depósito y conecta las bombas peristálticas.
3. Medio de alta tensión
   1. Prepara el medio como en la sección 2.2, pero con una mayor concentración de factor estresante (es decir, 3-5 g/L más en la adaptación de succinatos).
      Nota: Este protocolo es para adaptarse a un esfuerzo que puede ser transmitido a través del medio. En el caso de factores de estrés físicos como la temperatura, la agitación o la iluminación, el cultivo debe diseñarse en consecuencia.

3. Cultivo inicial

1. Inocular una sola colonia de Escherichia coli silvestre (E. coli) en un tubo de ensayo de 15 ml que contenga 4 ml de medio inicial.
2. Incuba el tubo de ensayo en una incubadora agitada durante 12 horas a 37 °C y 220 rpm.
3. Transfiere asépticamente 1 ml de precultivo al tarro de quimostato.
4. Incubar el tarro del quimostrato, que permite la aireación (aire 50 ml/min) y la agitación (200 rpm), a 37 °C durante 6 horas.

4. Adaptación al estrés

1. Conecta asépticamente el extremo del tubo de silicio de las bombas al tarro de quimosto.
2. Enciende la bomba de salida (10 ml/h o más) y recoge el cultivo. Nota: El cultivo debe estar en fase exponencial, normalmente entre 4 y 8 horas después del cultivo inicial.
3. Comprueba la densidad óptica (600 nm) del cultivo del tubo de salida.
4. Arranca la bomba de entrada (10 ml/h, correspondiente a una tasa de dilución de 0,1 h-1).
5. Comprueba la densidad óptica del cultivo a 600 nm desde el tubo de salida cada 24 horas.
6. Utiliza el quimostato durante 96 horas (9,6 veces más de rotación). Si la densidad óptica es estable, intercambiar el reservorio que contiene el medio de alta tensión. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detenga la bomba de entrada durante 6 horas. Reinicia la bomba de entrada y comprueba que la densidad óptica esté por encima de 0,2.
7. Aumenta gradualmente la concentración del factor tensor cambiando a un reservorio que contenga una concentración de factor de estrés más alta.
8. Toma muestras del cultivo adaptado cada vez que alcanza un hito (por ejemplo, una cepa adaptada a 100 g/L de estrés succinato) y guárdalas para un análisis genómico posterior.
9. Para el almacenamiento de la muestra, mezcle la muestra de cultivo (0,5 ml) con una solución esterilizada al 80% de glicerol (0,5 ml) y almacene a -80 °C. Nota: Si el microorganismo adquiere la capacidad de degradar el factor estresante durante el proceso de ALE, la concentración del factor estresante en el tarro de fermentación no es la misma que en el depósito fresco.

5. Aislamiento de colonia única de la deformación adaptada al esfuerzo

1. Preparar un medio de placa de agar (1,6% agar) que contenga el mismo factor de estrés y a la misma concentración de medio.
2. Emplata el cultivo de salida (0,1 ml) del quimiostato y incuba a 37 °C durante 16 horas.
3. Retira colonias individuales de la placa usando un palillo estéril e inocúlalas en tubos de ensayo de 15 ml que contengan el mismo factor de estrés y a la misma concentración media que en el quimiostato, e incuba durante 6 horas.
4. Transfiere 1 ml de caldo de cultivo a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de medio. Cosecha 0,5 ml del caldo de cultivo cada 1 hora y mide la sobredosis a 600 nm. Comparar la tasa de crecimiento de la deformación adaptada con la de la cepa tipo salvaje dado el factor de estrés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fermentador de mini-quimotista	Biotron Inc.	-	Fabricado por pedido especial
Tubería de silicio	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	El tamaño del tubo puede variar según la velocidad de dilución y el tamaño del tarro fermentador.
Jarra de depósito	Bellco	Botella de almacenamiento de medios	20 L
Productos químicos	Sigma-Aldrich	-	Grado reactivo
Glucosa	Sigma-Aldrich	G5767	Reactivo ACS
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	para biología molecular, adecuado para cultivo celular, ≥99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	Reactivo ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	Reactivo ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	Reactivo ACS, ≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	Reactivo ACS, ≥96%
Tiamina·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	grado de reactivo, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%