1. Recogida y almacenamiento de agua y coral para aislamiento microbiano
NOTA: Es esencial tomar las coordenadas y la temperatura de los sitios de muestreo. Si es posible, metadatos como la salinidad, el pH, la profundidad y la intensidad lumínica también pueden ayudar a encontrar enfoques de cultivo más precisos y a la futura interpretación de los datos. Para obtener resultados fiables, guarda las muestras durante el menor tiempo posible. Los microbiomas del agua/coral pueden cambiar considerablemente si las muestras no se mantienen a la temperatura adecuada y/o se almacenan durante largos periodos. Si el paso de aislamiento no se realiza inmediatamente después de la recogida, es crucial mantener las muestras a 4 °C hasta el procesamiento. Cuanto más tiempo se almacenen las muestras, incluso a 4 °C, más cambiará la comunidad microbiana.
- Toma muestras y almacena agua de mar.
- Recoge 500 mL de muestras de agua al menos triplicadas de cada sitio de muestreo objetivo. Preferiblemente usa botellas estériles con tapones de rosca.
- Si procesas el agua inmediatamente después de la recogida, mantén las botellas en RT durante un breve intervalo. Si el procesamiento de la muestra se realiza más tarde, mantén las botellas a 4 °C.
- Muestrea y almacena el coral.
- Utiliza un alicate estéril para cortar fragmentos de coral del mismo lugar de muestreo de las muestras de agua. Para evitar contaminaciones, toca los corales solo con guantes estériles.
- Enjuaga el fragmento de coral muestreado usando solución salina estéril de 20 mL (3% de NaCl en agua destilada) o agua de mar artificial para eliminar las bacterias libres y sueltas adheridas al agua de mar.
- Con pinzas, coloca cada fragmento de coral en un recipiente estéril de 250−500 mL con un tapón de rosca que contiene solución salina estéril.
- En el laboratorio, usando pinzas y alicates estériles, pesa 5 g de fragmentos de coral usando placas de Petri estériles de 100 mm x 20 mm sobre una báscula.
- Transfiere los 5 g de muestra de coral a un mortero estéril y maceral con un mano estéril.
- Utilizando una espátula estéril, transfiere la muestra macerada a un matraz de cultivo estéril que contenga 45 mL de solución estéril de NaCl al 3% y 10−15 perlas de vidrio de 5 mm. Utiliza un poco de la solución salina estéril de 45 mL para lavar el mortero y recuperar la máxima cantidad de macerato.
- Mantenga los frascos bajo agitación constante (150 x g) durante 16 horas a la temperatura del agua del lugar de muestreo.
NOTA: Para corales de aguas poco profundas, la temperatura óptima oscilará entre 24 y 28 °C. Este paso desprenderá microorganismos de diferentes compartimentos de coral, como los que están unidos a las células hospedadoras o los que viven dentro del tejido y el esqueleto. Tras este paso, los maceros de coral no deben almacenarse, y el paso de aislamiento debe realizarse al instante.
2. Aislamiento de bacterias sintéticas degradantes del estrógeno 17a-etinilestradiol (EE2) del agua de mar y/o corales
- Selecciona bacterias.
NOTA: Tras los pasos 1.1.2 y 1.2.7, la concentración de microorganismos en el agua de mar que se han desprendido de los diferentes macerados de coral será desconocida y variable. Para garantizar el aislamiento de colonias microbianas individuales en placas de Petri que contienen medios de agar, se necesitan diluciones en serie.- Realizar diluciones en serie de hasta 10-9 en solución salina estéril para muestras de coral y hasta 10-6 para muestras de agua. La pipeta diluye 5 veces antes de descartar la punta. Muestrea el vórtice durante 5 s cada vez antes de realizar la siguiente dilución en serie.
- Pipetear 100 μL de cada dilución en placas de Petri que contengan medio de agar de caldo de lisógeno NaCl al 3% (LB), y emplatarlas.
NOTA: Utiliza agar marino (MA) como medio alternativo. Se requieren triplicados de cada dilución para obtener resultados fiables. - Incubar las placas durante 1 a 3 días a la temperatura objetivo (por ejemplo, 26 °C). Revisa las matrículas una vez al día.
- Selecciona y aísla las colonias que presentan morfologías de crecimiento distintas en nuevas placas utilizando la técnica de placas de estría. Repite este paso tantas veces como sea necesario para que crezcan colonias puras en las placas.
- Si el procedimiento no se continúa instantáneamente hasta el paso 2.3.1, almacenar aislados a 4 °C o en glicerol como se describe en la sección 2.2.
- Prepara los stocks de glicerol.
NOTA: Este paso es opcional y puede utilizarse para el almacenamiento a largo plazo de stocks bacterianos.- Elige colonias individuales de la placa fresca o de las placas almacenadas a 4 °C y inocúlalas de forma independiente en 2 mL de medio LB estéril.
- Colocar los tubos bajo agitación constante (150 x g) a 24−28 °C durante la noche (ON).
- Añade 1 mL de los cultivos bacterianos del paso 2.2.2 y glicerol estéril a una concentración final del 20% a los 2 mL de crioviales.
- Deja los crioviales ENCENDIDOS a 4 °C.
- Coloca las plantas bacterianas glicerolas a -80 °C hasta que sea necesario.
- Realizar la prueba de capacidad de degradación EE2.
- Activa los aislados en el caldo LB o medios alternativos. Para ello, elige una sola colonia de las placas frescas o de la placa almacenada a 4 °C, e inocula 2 mL de medio estéril LB. En caso de que sea un stock de glicerol, primero se estria sobre placas de agar LB e incuba a 24−28 °C ON para que crezcan colonias individuales. Coloque el tubo que contiene el medio LB inclinado bajo agitación constante (150 x g) a 24−28 °C ON.
- Tras el crecimiento bacteriano, haz pellets a las células centrifugándolas a 8.000 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente (RT). Descarta el sobrenadante y, pipeteando suavemente arriba y abajo, vuelve a suspender las células en un volumen igual (2 mL) de agua salina para lavar el caldo LB restante.
- Repite el paso 2.3.2 dos veces para garantizar que no queden rastros de la fuente de carbono, resuspendiendo las células en un volumen igual de solución salina. Por ejemplo, si se ha empezado con un cultivo de 2 mL, resuspende las células en un volumen final de solución fisiológica de 2 mL.
- Inocular las células lavadas y resuspendidas en medio de cultivo Bushnell Haas mínimo (BH Broth) que contiene EE2 como única fuente de carbono.
NOTA: EE2 se disuelve en etanol a una concentración final de 5 mg/L en el medio de cultivo. Haz cambios en el tipo de contaminante y/o la concentración si es necesario. - Evaluar el crecimiento bacteriano por densidad óptica a 600 nm y/o las colonias formando unidades (UFC) en un medio de agar LB, durante 16−72 horas de incubación.
NOTA: Alternativamente, los microorganismos pueden aislarse directamente en medios mínimos que contengan EE2 u otros compuestos como única fuente de carbono. Este paso dirigiría la selección y evitaría un crecimiento indeseable.