Enriquecimiento selectivo y aislamiento de bacterias marinas degradadoras de petróleo a partir de muestras de agua de mar

Resumen

Fuente: Villela, H. D. M. , et al. Prospección de cepas microbianas para biorremediación y desarrollo probiótico para la investigación y preservación de metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra el aislamiento selectivo de bacterias marinas degradadoras del petróleo mediante el enriquecimiento de muestras de agua de mar en medios petrolíferos, permitiendo la recuperación de cepas puras con posibles aplicaciones en la biorremediación del petróleo crudo y la limpieza ambiental.

Protocolo

1. Recogida y almacenamiento de agua y coral para aislamiento microbiano

NOTA: Es esencial tomar las coordenadas y la temperatura de los sitios de muestreo. Si es posible, metadatos como la salinidad, el pH, la profundidad y la intensidad lumínica también pueden ayudar a encontrar enfoques de cultivo más precisos y a la futura interpretación de los datos. Para obtener resultados fiables, guarda las muestras durante el menor tiempo posible. Los microbiomas del agua/coral pueden cambiar considerablemente si las muestras no se mantienen a la temperatura adecuada y/o se almacenan durante largos periodos. Si el paso de aislamiento no se realiza inmediatamente después de la recogida, es crucial mantener las muestras a 4 °C hasta el procesamiento. Cuanto más tiempo se almacenen las muestras, incluso a 4 °C, más cambiará la comunidad microbiana.

1. Toma muestras y almacena agua de mar.
   1. Recoge 500 mL de muestras de agua en al menos triplicado de cada sitio de muestreo objetivo. Preferiblemente, usa botellas estériles con tapones de rosca.
   2. Si procesas el agua inmediatamente después de recogerla, mantén las botellas a temperatura ambiente (RT) durante un breve intervalo. Si el procesamiento de la muestra se realiza más tarde, mantén las botellas a 4 °C.
2. Muestrea y almacena el coral.
   1. Utiliza un alicate estéril para cortar fragmentos de coral del mismo lugar de muestreo que las muestras de agua. Para evitar contaminaciones, toca los corales solo con guantes estériles.
   2. Enjuaga el fragmento de coral muestreado usando 20 mL de solución salina estéril (3% de NaCl (cloruro de sodio) en agua destilada) o agua de mar artificial para eliminar las bacterias libres y aflojas del agua de mar.
   3. Con pinzas, coloca cada fragmento de coral en un recipiente estéril de 250−500 mL con un tapón de rosca que contiene solución salina estéril.
   4. En el laboratorio, usando pinzas y alicates estériles, pesa 5 g de fragmentos de coral usando placas de Petri estériles de 100 mm x 20 mm sobre una báscula.
   5. Transfiere los 5 g de muestra de coral a un mortero estéril y maceral con un mano estéril.
   6. Utilizando una espátula estéril, transfiere la muestra macerada a un matraz de cultivo estéril que contenga 45 mL de solución estéril de NaCl al 3% y 10−15 perlas de vidrio de 5 mm. Utiliza un poco de la solución salina estéril de 45 mL para lavar el mortero y recuperar la máxima cantidad de macerato.
   7. Mantenga los frascos bajo agitación constante (150 x g) durante 16 horas a la temperatura del agua del lugar de muestreo.
      NOTA: Para corales de aguas poco profundas, la temperatura óptima oscilará entre 24 y 28 °C. Este paso desprenderá microorganismos de diferentes compartimentos de coral, como los que están unidos a las células hospedadoras o los que viven dentro del tejido y el esqueleto. Tras este paso, los maceros de coral no deben almacenarse, y el paso de aislamiento debe realizarse al instante.

2. Aislamiento de bacterias degradadoras de petróleo del agua de mar y/o corales

1. Preparar un medio mínimo que contenga una fracción soluble en aceite en agua (oWSF) y una fracción insoluble en agua en aceite (oWIF) como única fuente de carbono.
   1. Añadir un 1−2% de crudo a 500 mL de agua destilada estéril. Utiliza un matraz filtrante abierto en la parte inferior para extraer la fracción soluble sin alterar la capa superior de la fracción insoluble.
   2. Mantén la mezcla bajo agitación constante a 24−28 °C a 150 x g durante 48 horas.
   3. Coloque el matraz filtrante que contiene las fracciones de crudo sobre una superficie estable y espere 10−20 minutos para permitir la separación de fracciones solubles e insolubles.
   4. Transfiere el oWSF a un nuevo matraz estéril, salvando el oWIF abriendo el matraz inferior del filtro y retirando la fracción soluble.
   5. Utilizando todo el oWSF recuperado en el paso anterior (~400 mL), preparar 1 L de medio BH (Bushnell Haas) con mínimo de agar que contenga oWSF como única fuente de carbono.
   6. Utilizando el oWIF que queda en el matraz del paso 2.1.4, prepare 1 L de medio de agar mínimo BH que contenga oWIF como única fuente de carbono.
2. Aislar bacterias degradadoras de oWSF y oWIF.
   1. Utilizando agua y macerado de coral de los pasos 1.1.2 y 1.2.7, respectivamente, diluye las muestras hasta ^10-6 en solución salina estéril como se indica a continuación.
3. Realizar diluciones en serie de hasta ^10-9 en solución salina estéril para muestras de coral y hasta ^10-6 para muestras de agua. La pipeta diluye 5 veces antes de descartar la punta. Muestrea el vórtice durante 5 s cada vez antes de realizar la siguiente dilución en serie.
4. Pipetear 100 μL de cada dilución en placas de Petri que contienen medios de agar BH-oWSF y BH-oWIF y emplatarlas.
5. Incubar las placas durante 1 a 3 días a la temperatura objetivo (por ejemplo, 26 °C). Revisa las matrículas una vez al día.
6. Selecciona y aísla las colonias que presentan morfologías de crecimiento distintas en nuevas placas utilizando la técnica de placas de estría. Repite este paso tantas veces como sea necesario para que crezcan colonias puras en las placas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Botella de almacenamiento de medios PYREX de 500 mL	thomas scientific/Corning	1743E20/1395-500	Usado para tomar muestras de agua.
Botellas aspiradoras de 500 mL	thomas scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Se usaba para separar las fracciones de aceite.
Alicate de 6 pulgadas	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Se usaba para cortar fragmentos de coral.
Agar-agar	Himedia	PCT0901-1KG	Antes hacía medios sólidos.
Caldo Haas de Bushnell	Himedia	M350-500G	Se utiliza como medio mínimo para ser complementado con fuentes de carbono.
Matraz Erlenmeyer	Thomas Scientific/DWK Ciencias de la Vida (Kimble)	4882H35/26500-125	Se usan para incubar macerados de coral con cuentas de vidrio.
Campana de flujo laminar			Necesitaba trabajar en condiciones estériles.
Luria Bertani Broth, molinero (Miller Luria Bertani Broth)	Himedia	M1245-1KG	Se usa como medio rico para cultivar bacterias.
Agar marino 2216 (Agar marino Zobell)	Himedia	M384-500G	Se usa como medio rico para cultivar bacterias.
Incubadora de Agitadores Orbitales			Se usa para incubar medios líquidos y aceite.
Incubadora de platos			Se usan para incubar placas.
Morcero y Mano de porcelana	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Se usan para macerar fragmentos de coral.
Centrífuga refrigerada			Se usa para centrifugar cultivos bacterianos.
Espectrofotómetro			Se utiliza para medir la densidad óptica de cultivos bacterianos.
Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard	Promega	A1120	Usado para la extracción de ADN de cepas microbianas.