Seguimiento del crecimiento bacteriano a resolución de célula única en un sistema microfluídico

Resumen

Fuente: Cabeen, M. T., et al. Análisis microfluídico de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para observar el crecimiento bacteriano a nivel de célula única. Muestra cómo las células bacterianas no móviles, confinadas en trincheras a microescala, son continuamente nutridas e imaginadas bajo un microscopio de fluorescencia. La configuración permite la visualización en tiempo real de la división celular y el seguimiento de linaje a lo largo de varias generaciones.

Protocolo

1. Casting de dispositivos PDMS

1. En un ambiente libre de polvo, mezcle polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado a una proporción de 10:1 y desgasifice al vacío durante al menos 10 minutos.
2. Coloca un maestro de silicio (o una réplica de epoxi o poliuretano de este) sobre un trozo de papel de aluminio sin romper dentro de una placa de Petri de poliestireno. Vierte la mezcla desgasificada de PDMS sobre el maestro hasta una profundidad de aproximadamente 5 mm. Desgasifica la placa de Petri durante al menos 10 minutos. Utiliza un suave chorro de aire para romper las burbujas superficiales.
   NOTA: Una réplica maestra de plástico puede flotar parcialmente durante la desgasificación; Si esto ocurre, presiona la réplica hacia abajo con un aplicador de plástico limpio.
3. Curar el PDMS durante al menos 1 hora en un horno a 60 °C y enfriarlo hasta temperatura ambiente. Retira el papel de aluminio que contiene el master y el PDMS curado de la placa de Petri. Quita con cuidado el papel de aluminio de la parte trasera del máster y luego despega con cuidado el PDMS del máster.
   NOTA: Alternativamente, el PDMS puede curarse durante la noche a temperatura ambiente. La relativa fragilidad de un maestro de obleas de silicio puede superarse utilizando adhesivo epoxi para unir permanentemente la oblea a un disco de aluminio de 1/16 de pulgada de grosor del mismo tamaño que la oblea.
4. Como una oblea suele incluir varios dispositivos microfluídicos con dimensiones ligeramente diferentes, corta un solo dispositivo a medida usando un bisturí limpio y afilado.
   NOTA: Para trabajos rutinarios con Bacillus subtilis , utiliza dispositivos con trincheras de celda de 1,0 μm de ancho.

2. Punzonado y unión de dispositivos

1. Coloca un trozo de cinta de oficina translúcida (véase Tabla de Materiales) sobre el lado con patrón del dispositivo para mejorar la visibilidad de los rasgos estampados. Los puertos de entrada y salida se identifican como áreas circulares en extremos opuestos de los canales fluídicos visibles (Figura 1). Para mejorar su visibilidad al perforar los agujeros del dispositivo para los pasadores de entrada y salida, marca las entradas y salidas con puntos usando un marcador de punta fina.
   NOTA: Para asegurar que los pines de entrada y salida no estén saturados, se perfora cada canal alterno, comenzando por el canal justo debajo del designador alfabético del dispositivo.
2. Gira el dispositivo PDMS para que el lado con patrón quede hacia abajo y perfora el dispositivo hasta los puntos marcados usando una perforadora de biopsia de 0,75 mm; Descarta las perforaciones.
   NOTA: Los dispositivos se perforan con el lado patrón hacia abajo porque el orificio generado por la perforadora suele estar ligeramente ensanchado donde el punzón entra en el polímero. Perforar el dispositivo en una orientación invertida asegura que el agujero en el lado con patrón tenga un borde nítido.
3. Utilizando un estereomicroscopio, asegúrate de que los orificios perforados se solapen con las zonas de entrada y salida del dispositivo. Utiliza pinzas de punta fina para eliminar cualquier fragmento superfluo de PDMS de los agujeros perforados.
4. Usa cinta adhesiva para quitar el polvo de ambos lados del dispositivo y colócalo en una placa de Petri de poliestireno limpia. Prepara un vaso de tapa de 22 mm x 40 mm humedeciéndolo con alcohol isopropílico al 100% y frotando con una toallita limpia; seca con un chorro de aire libre de polvo o nitrógeno.
5. Coloca el dispositivo PDMS perforado con la parte lateral hacia arriba junto con el cristal de la tapa limpia en un limpiador de plasma de osígeno.
   1. Tratamiento con plasma del dispositivo con los siguientes ajustes: vacío, 70 mTorr; Presión O₂, 200 mTorr; duración, 15 s; Potencia, 30 W. Inmediatamente después de finalizar el periodo de tratamiento con plasma, retirar el dispositivo y cubrir el cristal del limpiador de plasma.
   2. Invierte el PDMS y colócalo en el centro del cristal de cubierta para que el lado con patrón toque el cristal; Asegúrate de que los canales de alimentación (que van entre las zonas de entrada y salida) estén alineados con el eje largo del cristal de la cubierta. Presiona muy suavemente para asegurarte de que el PDMS sella contra el cristal.
6. Hornea el dispositivo ensamblado en un horno durante al menos 1 hora a 60 °C. Después de hornear, verifica manualmente que el PDMS esté unido al vidrio presionando suavemente una esquina del dispositivo.
   NOTA: Una vez que el dispositivo está adherido, debe usarse en un plazo de 24 horas, ya que el polímero se volverá cada vez más hidrofóbico con el paso del tiempo tras el tratamiento con plasma.

3. Preparación de fontanería microfluídica

1. Cortar longitudes de tubo de polímero (diámetro interior (ID) 0,02 pulgadas, diámetro exterior (OD) 0,06 pulgadas) a longitudes adecuadas para llegar desde la bomba de jeringuilla hasta el aparato de conmutación (si se utiliza) y el dispositivo cuando esté montado en el microscopio. Corta tantas longitudes como haya carriles microfluídicos.
2. Montar uniones en Y para válvulas de presión (si se usan) cortando y fijando longitudes de 2 cm de tubo flexible de silicona (0,03 pulgadas de diámetro interior, 0,065 pulgadas de diámetro exterior) a las barras superiores de la "Y" y longitudes de 1 cm de tubo de silicona a la barra inferior de la "Y".
3. Cortar longitudes de 10 cm (o apropiados) de tubo polimérico; conéctalas en un extremo a la unión de conmutación insertándolas en los segmentos de tubo de silicona de 1 cm en la barba inferior de la "Y". Conéctalas en el otro extremo a agujas de 21G que han sido retiradas de sus adaptadores de jeringuilla de plástico y dobladas aproximadamente 90° aproximadamente 9 mm desde el extremo de la aguja.
4. Conecta agujas romas de 21 G a un extremo de los segmentos del tubo que irán desde las jeringuillas hasta el aparato de interruptor insertando las agujas en el tubo. Inserta los otros extremos de cada tramo de tubo en los segmentos de tubería de silicona en las espinas de entrada de las uniones en Y.
   NOTA: Utiliza algún tipo de aparato para mantener las válvulas de presión y las uniones en su sitio; esto se puede fabricar fácilmente a partir de una caja de punta de micropipeta (Figura 2D).
5. Corta tramos de tubo de polímero para transportar los residuos desde la salida del dispositivo hasta un vaso de desechos. Conectarlos por un extremo a agujas dobladas de 21-G preparadas como se ha descrito antes. Pega el otro extremo de los tubos en un vaso de desechos.
6. Prepara los volúmenes apropiados de medios que contengan 0,1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y llena el tamaño y número deseados de jeringuillas. Conecta las jeringuillas cargadas con BSA a las agujas preparadas de 21G acopladas al tubo de entrada y carga las jeringuillas en bombas de jeringuillas.
   NOTA: Para experimentos típicos, se utilizan 5 canales del dispositivo, cada uno con una jeringuilla de 20 mL. Un experimento en el que se intercambia el medio requerirá 2 bancos de 5 jeringuillas cada uno. Aquí, la bomba que contiene el primer banco se denomina bomba de fase 1, y la bomba que contiene el segundo banco, con el medio posterior al cambio, se denomina bomba de fase 2.
7. Purga el aire de la tubería de entrada haciendo funcionar las bombas de jeringuilla a un caudal alto (>500 μL/min), comenzando orientando las bombas verticalmente y golpeando las jeringuillas para llevar burbujas de aire a la superficie. Una vez que el aire ha sido purgado de las jeringuillas, coloca la bomba de la jeringuilla horizontalmente y avanza progresivamente con golpes o golpes las líneas de polímero de las jeringuillas hacia arriba a través del aparato de interruptor para desalojar y purgar las burbujas de aire. Repite este proceso para el segundo banco de jeringuillas (si cambias de medio).
8. Después de purgar las burbujas de aire, ajusta la bomba de jeringuilla de fase 2 (es decir, con el medio que se usará en segundo lugar, después del cambio) a 1,5 μL/min y luego pausa el flujo. Coloca pequeños clips de aglutinante en los segmentos de tubo flexible en la rama de las uniones en Y correspondientes a la segunda fase del medio. Continúe haciendo funcionar la bomba de jeringuilla de fase 1 a un caudal moderado (por ejemplo, 10 μL/min) durante al menos 30 minutos para purgar el segundo medio desde la tubería de entrada aguas abajo de la unión en Y.

4. Preparación de cultivos celulares

1. Cultiva una precultura de la cepa de interés en el medio deseado de la noche a la mañana, hasta la fase estacionaria. La cepa bacteriana debe contener una mutación que inmovilice a las células, para que no salgan nadando fuera de los canales del dispositivo.
   NOTA: En este protocolo, la cepa bacteriana es B. subtilis 3610 que contiene una sustitución A233V por bruja(esta mutación hace que el flagelo sea recto en lugar de helicoidal, evitando la motilidad celular), un reportero PrsbV-mNeonGreen para el estrés celular, y un reportero constitutivo Phyperspank-mNeptune (rojo) para resaltar las células. El medio Lennox de Luria-Bertani (LB) se utiliza en el protocolo de ejemplo. Las cepas típicas para experimentos de microfluídica contienen uno o más reporteros transcripcionales fluorescentes y una proteína fluorescente citoplasmática producida de forma constitutiva para facilitar la detección automática de células. No se observaron defectos de crecimiento cuando se utilizó un medio rico en LB Lennox, pero el crecimiento de B. subtilis en medios mínimos puede inhibirse bajo condiciones microfluídicas porque los sideróforos secretados son eliminados por el flujo del medio. En tales circunstancias, el crecimiento puede restaurarse añadiendo citrato de sodio y cloruro férrico al medio, como se informa para el medio S750.
2. La mañana del experimento, diluir las células de B. subtilis 1:50 en un matraz desconcertado de 250 mL que contenga 25 mL de medio de crecimiento. Cultiva las células durante 5 - 6 horas en cultivo agitado a 37 °C hasta una densidad óptica superior a 1.
   NOTA: Un cultivo celular denso es preferible porque las células de B. subtilis en fase estacionaria son más pequeñas y se encuentran menos frecuentemente en cadenas celulares, facilitando la carga del dispositivo. Diferentes especies bacterianas pueden requerir otros medios o condiciones de crecimiento para una carga óptima.
3. Utilizando una jeringuilla equipada con un filtro de tamaño poro de 5 μm, filtra aproximadamente 15 mL de cultivo celular en un tubo cónico de 15 mL para eliminar las cadenas celulares de B. subtilis (no es necesario para E. coli y puede no ser necesario en otras especies).
   NOTA: Relativamente pocas células deben eliminarse; El filtrado debería estar turbio.
4. Centrifuga el cultivo filtrado durante 10 minutos a 4.000 x g a temperatura ambiente. Vierte el sobrenadante y vuelve a suspender la cápsula en el líquido sobrenadante residual que queda en el tubo, añadiendo aproximadamente 500 μL de medio fresco si es necesario para facilitar el pipeteo de la suspensión celular.

5. Carga de dispositivos

1. Coloque suavemente las puntas vacías y finas de micropipeta de carga en gel (véase Tabla de Materiales) en los orificios de salida del dispositivo microfluídico.
2. Utilizando puntas finas de carga en gel con una micropipeta P200, pasiva el dispositivo inyectando un medio que contenga 1 mg/mL de BSA en los orificios de entrada, observando las puntas en los orificios de salida para monitorizar el llenado de los canales microfluídicos (Figura 2A). Incuba el dispositivo a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.
   NOTA: La BSA se utiliza comúnmente como agente bloqueante o pasivante que se une a la superficie hidrofóbica del polímero PDMS, aumentando su hidrofilia y reduciendo la unión de otras proteínas o de las células (a través de moléculas de la superficie celular).
3. Utilizando puntas finas de carga de gel, carga cada canal con las celdas resuspendidas (de la Sección 4), utilizando las puntas del canal de salida para monitorizar el progreso de las celdas a través del dispositivo (Figura 2B).
   NOTA: La carga se facilita ajustando la micropipeta P200 a su volumen máximo de 200 μL y luego aspirando un cojín de aire antes de aspirar un pequeño volumen (aproximadamente la mitad del volumen de la sección delgada de la punta de la pipeta) de celdas. El volumen de las celdas resuspendidas no tiene por qué ser preciso, ya que el volumen del dispositivo PDMS es pequeño en relación con el de la micropipeta. No conocemos un límite superior a la densidad de las células resuspendidas, siempre que la suspensión celular pueda ser pipeteada en el dispositivo. Los grumos celulares pueden obstruir el dispositivo y deben evitarse mediante pipeteo exhaustivo y/o mezcla de vórtice.
4. Retira suavemente las puntas de carga de gel de los orificios de salida, trabajando una a una para evitar daños en el dispositivo.
5. Centrifugar el dispositivo en una microcentrífuga de mesa en un adaptador de rotor adecuado a aproximadamente 6.000 x g durante 10 minutos (Figura 2C).
   NOTA: Se utilizó un adaptador de rotor de aluminio mecanizado a medida diseñado para caber en un rotor de microcentrífuga (Figura 2C); se pueden usar diferentes modelos de centrífuga con adaptadores de rotor adecuados. La característica importante del adaptador es que proporciona fuerza lateral en la dirección de los extremos cerrados de las zanjas de las celdas, forzando así las celdas hacia los canales laterales.
6. Verifica la carga correcta bajo el microscopio (Figura 3), pero sin fijar el dispositivo al portaláminas/inserto del escenario.
   NOTA: En este protocolo, se utiliza un objetivo de inmersión en aceite Ph3 de 60X y 1,4 NA tanto para la verificación en esta etapa como para la obtención posterior de imagen.

6. Montaje, equilibrio y montaje del dispositivo

1. Monta cuidadosamente el dispositivo cargado en un inserto de escenario pegando el cristal de la cubierta a ambos lados del PDMS en la parte inferior del inserto de etapa (es decir, invierte el inserto de etapa antes de acoplar el dispositivo). Invierte el conjunto del dispositivo de inserción de la etapa para que el PDMS quede hacia arriba y colócalo sobre una superficie blanda, como una limpieza libre de polvo (Figura 2D).
2. Ajusta el caudal de la bomba de jeringuilla de fase 1 a 35 μL/min. Trabajando con un carril a la vez, inserta la aguja de entrada y luego la aguja de salida (es decir, yendo al vaso de desecho; Figura 2E).
3. Limpia cualquier exceso de medio con una toallita limpia y libre de polvo e inspecciona visualmente el dispositivo en busca de fugas. Examina el tubo de salida para detectar la aparición de celdas en exceso (normalmente como una franja turbia) y el menisco medio, que se desplazará lentamente hacia el vaso de desechos.
4. Permite que el dispositivo funcione a 35 μL/min durante aproximadamente 15 - 30 minutos, hasta que todos los carriles conectados se drenen hacia el vaso de desechos.
5. Ajusta la bomba de jeringuilla de fase 1 a 1,5 μL/min y pausa el flujo. Lleva todo el aparato de bomba y dispositivo al microscopio (este proceso se facilita colocando todo sobre un carro con rodas) y reinicia el flujo del medio de fase 1 a 1,5 μL/min. Monta cuidadosamente el inserto de la etapa con el dispositivo sobre un microscopio de fluorescencia invertida, usando cinta cuando sea necesario para enrutar los tubos de entrada y salida.
6. Localiza las posiciones deseadas en el dispositivo para la imagen y comienza a hacer la imagen según lo desee. Cabe señalar que las células suelen requerir unas pocas horas (aproximadamente 10 generaciones) para alcanzar un crecimiento exponencial en estado estacionario, y el inicio de la adquisición de imagen puede retrasarse según se desee, de modo que la imagen comience después del periodo de equilibrio.
   NOTA: El crecimiento en estado estacionario de las células mantenidas en fase exponencial debe verificarse durante el análisis posterior de la imagen mediante el seguimiento de los tiempos de división celular y asegurándose de que han alcanzado un valor mínimo constante.

Resultados

Figura 1: Esquema del dispositivo microfluídico. El esquema de un dispositivo se muestra aproximadamente a escala. El designador alfabético está etiquetado junto con las zonas de entrada y salida que se perforan para conectar las agujas de ...

Materiales