$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Condiciones de cultivo bacteriano
- Trabajando bajo una campana laminar, se utilizan 100 μL de una reserva de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 marcada con proteína fluorescente verde (GFP) (1 × 107 mL-1, almacenada a -80 °C) para inocular 5 mL de medio Luria-Bertani (LB). Incubar a 30 °C mientras agitas a 250 rpm durante la noche.
- Al día siguiente, resuspende 100 μL del cultivo nocturno en medio de 5 mL LB e incuba bajo las mismas condiciones durante 5 horas (fase exponencial). Muestrea una alicuota de 1 mL en un tubo de 2 mL, déjala enfriar hasta temperatura ambiente (~15 min) y centrifuga (2300 x g durante 5 min).
- Quita el sobrenadante y añade 1 mL de buffer de motilidad al pellet. Vórtice brevemente para homogeneizar la muestra. Diluye para alcanzar la concentración celular deseada, por ejemplo, 5 x 105 mL-1.
- Para experimentos que involucren comunidades naturales, como las derivadas de arroyos, prepara un medio de cultivo no selectivo. Por ejemplo, utiliza agua de arroyo filtrada y autoclavada por estéril o un medio artificial de agua de arroyo modificado con una fuente de carbono compleja (medio LB).
2. Preparación de un dispositivo microfluídico en polidimetilsiloxano (PDMS)
- Diseña la geometría porosa deseada mediante un software de dibujo asistido por ordenador (CAD), que consiste en una matriz de círculos (es decir, el obstáculo impermeable al flujo), descrito por el tamaño del radio y las coordenadas del centro.
NOTA: Un ejemplo de geometría porosa con tamaños de grano y poros aleatorizados se proporciona en la Figura 1A. Un canal de observación sin obstáculos cerca de la salida facilita la adquisición de curvas de ruptura (BTC). - Según la geometría elegida, preparar un molde usando fotolitografía estándar SU-8.
NOTA: Alternativamente, los moldes también pueden encargarse en una instalación dedicada a la microfabricación. Para obtener un flujo de fluidos heterogéneo en el plano horizontal, es importante diseñar el grosor de la cámara de microfluídica del mismo orden de magnitud que el tamaño medio de la garganta de los poros. Sin embargo, asegúrate de que las dimensiones del dispositivo microfluídico sean adecuadas para la observación bajo el microscopio (por ejemplo, trabajar en láminas de microscopio). - Prepara 50 g de PDMS añadiendo un 10% de reticulante (dimetilo, copolímero de metilhidrógeno siloxano) al 90% de elastómero en peso, usando una jeringuilla sin aguja. Trabaja en condiciones limpias y evita el polvo tanto como sea posible. Mezcla los dos reactivos en un recipiente limpio y desechable y aplica vacío (100 mbar) durante 30 minutos para eliminar el aire disuelto y las burbujas del PDMS viscoso.
- Coloca el molde en una placa de Petri (100 mm de diámetro, 15 mm de alto). Vierte el PDMS sobre el molde a la altura deseada (por ejemplo, 2-5 mm). Cubre la placa de Petri y déjala a 60 °C durante 4 horas (toda la noche para capas más gruesas) para curar.
NOTA: Para fines de visualización, la luz debería poder pasar a través del PDMS; por tanto, es deseable una capa fina entre 2 mm y 5 mm. Las capas más gruesas (>5 mm) reducen la transparencia del dispositivo, y las más finas sufren deformaciones durante la aplicación. - Retira el moho del horno y deja que el dispositivo microfluídico se enfríe hasta la temperatura ambiente. Una vez enfriado, retira cuidadosamente la parte deseada del PDMS con un bisturí.
NOTA: Las presiones fuertes sobre el moho provocan fracturas. No toques el PDMS con las manos desnudas, ya que las huellas dactilares afectarán a la transparencia óptica. - Sella temporalmente la parte inferior del canal PDMS (donde se ha grabado la geometría deseada) con cinta. Con un perforador de biopsias de 0,5 mm de diámetro, perfora el canal microfluídico para crear una entrada y una salida que encajen en el tubo de 0,5 mm (diámetro interior).
NOTA: La naturaleza blanda del PDMS asegurará la tensión una vez que se inserte el tubo. No se pueden fabricar canales de entrada y salida después de que el PDMS ha sido sellado al cristal. - Sella el canal microfluídico mediante enlace plasmático de oxígeno utilizando el generador de alta frecuencia (enlace de plasma, Tabla de Materiales). Para esto, limpia una lámina de vidrio silicato (25 mm x 75 mm) con etanol y déjala secar. Retira la cinta del canal PDMS y coloca el canal con el lado poroso hacia arriba. Trata las superficies de vidrio silicato y PDMS con plasma durante unos 45 s a temperatura ambiente.
- Coloca el canal PDMS sobre la lámina de vidrio silicato y calienta a 100 °C durante 30 minutos en una placa eléctrica.
- Retira el dispositivo microfluídico de la placa caliente y enfríalo a temperatura ambiente. Conecta la entrada del canal PDMS con tubos. Aplica un vacío durante 30 minutos para eliminar el aire del PDMS, que es casi impermeable a los fluidos pero permeable a los gases.
- Preparar 100 mL de tampón de motilidad (10 mM fosfato de potasio, 0,1 mM de ácido etilendediaminético tetraacético (EDTA), suplementado con 1% p/v de glucosa, pH 7,0) e inyectar 1 mL en el dispositivo microfluídico usando una bomba de jeringuilla operada a 10 μL min-1.
NOTA: Como el PDMS está subsaturado de gas (debido al paso previo de vacío), las burbujas desaparecerán en ~30 minutos.
3. Analizar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos PDMS
- Coloque el dispositivo microfluídico PDMS previamente saturado con el buffer de motilidad en la etapa del microscopio. Utiliza cinta adhesiva para fijar la tubería y así minimizar la perturbación del flujo durante el movimiento de la etapa.
- Mueve la etapa del microscopio al canal de observación cerca de la salida. Utilizando microscopía de campo claro o contraste de fase, enfoca el centro del canal de observación y ajusta la magnificación para visualizar las células bacterianas individuales.
- Cambia la configuración del camino de la luz a microscopía de fluorescencia y ajusta el tiempo de exposición de la cámara para resolver células bacterianas individuales (por ejemplo, 100 ms), o de modo que las señales de fluorescencia de las células sean al menos 3 veces más fuertes que el ruido de fondo.
- A continuación, introduce el tubo de entrada en un tubo de 2 mL que contiene la suspensión bacteriana. Invierte la dirección de la bomba y comienza a retirar la suspensión a un caudal de 1 μL min-1.
- Escanea la sección transversal de todo el canal de observación, registrando una imagen compuesta cada 2 minutos, durante toda la duración del experimento.
