Transfección de un sistema de expresión génica inducible en células que expresan una proteína efectora bacteriana

Resumen

Fuente: Berens, C. et al. Aplicación de un sistema de expresión inducible para estudiar la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con la señalización intracelular. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demuestra el uso de un sistema de expresión inducible para identificar dónde la proteína efectora bacteriana CaeB interrumpe la cascada apoptótica del huésped. Describe los pasos para transfectar células que expresan CaeB con un sistema sensible a la tetraciclina para inducir la expresión génica proapoptótica y así identificar el punto de interrupción dentro de la cascada.

Protocolo

1. Transfección de la línea celular estable con el sistema de vectores de expresión inducible

1. Semillan células embrionarias humanas de riñón (HEK)293 que expresan de forma estable proteína fluorescente verde (GFP) o GFP-CaeB en una placa de 12 pozos a una densidad de 1 x 10⁵ células por pozo.
2. 19 horas después de la siembra, co-transfecta las células con el plásmido regulador y el plásmido de respuesta, ya sea codificando Bax o caspasa activada 3.
   1. Co-transfecta las células estables HEK293 con 100 ng de plásmido regulador pWHE125-P (Figura 1) y 100 ng de los plásmidos de respuesta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 2) y 0,4 μl de polietilenimina.
   2. Prepara el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el reactivo de transfección de polietilenimina cada uno en 75 μl de medio Opti-MEM e incuba exactamente durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Para la formación compleja, incuba ambas mezclas juntas durante 15 minutos en tiempo de descanso.
3. Añade la solución de polietilenimina/ADN gota a las células e incuba a 37 °C con un 5% de_CO2.

2. Inducción de la apoptosis

1. 5 horas después de la transfección, inducir la expresión de las proteínas proapoptóticas mediante la adición de 1 μg/ml de doxiciclina al medio de cultivo. Incubar células durante 18 horas a 37 °C con un 5% de_CO2.

Resultados

Figura 1. Resumen esquemático del plásmido regulador pWHE125. Elementos esenciales para la propagación en bacterias, incluyendo un origen de replicación (ori pBR) y un casete resistente a antibióticos contra la ampicilina (Amp^R

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Tecnologías vitales	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Estreptococo	Tecnologías vitales	15140-122
OptiMEM	Tecnologías vitales	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polietilenimina	Policienes	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891