Detección de la expresión de enzimas objetivo en células bacterianas genéticamente modificadas

Resumen

Fuente: Kim, H. et al., Cribado Multienzimático usando un sistema de cribado enzimático genético de alto consumo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra un método de cribado genético para detectar la expresión enzimática utilizando bibliotecas metagenómicas de fosmid y sustratos cromogénicos. La citometría de flujo identifica y aísla células individuales que producen productos coloreados, permitiendo la selección de alto rendimiento de células activas que expresan enzimas.

Protocolo

1. Preparando la Biblioteca Metagenómica con un sistema de cribado enzimático genético para la detección de p-nitrofenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. Construir una biblioteca metagenómica en Escherichia coli con un vector fosmid utilizando un kit de producción de biblioteca fosmid.
   2. Alicuota de 100 μl de la biblioteca para almacenamiento a −70 °C, que es una fuente de células bibliotecarias metagenómicas.
      NOTA: La densidad óptica de una muestra medida en una longitud de onda de 600 nm (OD₆₀₀) de este stock de biblioteca es aproximadamente 100.
   3. Descongelar 100 μl de la biblioteca metagenómica estándar sobre hielo e inocular en un matraz de 500 ml que contenga 50 ml de Luria-Bertani (LB) y 12,5 μg/ml cloranfenicol, seguido de una incubación a 37 °C durante 2 horas.
   4. Cosechar las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1.000 x g durante 20 minutos a 4 °C.
   5. Suspende rápidamente el pellet en 50 ml de agua destilada helada (DW) y centrifuga a 1.000 x g durante 20 minutos a 4 °C de nuevo.
   6. Suspende el pellet en 50 μl de diez libre helado con glicerol al 10% (v/v). Utiliza 50 μl de esta alícuta de celda para electroporación.
   7. Colocar la mezcla de celdas electrocompetentes de 50 μl y ADN pGESS(E135K) (100 ng) en una cubetas de electroporación helada y electroporar (1,8 kV/cm, 25 μF) la mezcla.
   8. Añade rápidamente 1 ml de caldo super óptimo con medio de represión catabolica (SOC) y resuspende las células con cuidado.
   9. Transfiere las células a un tubo de fondo redondo de 14 ml usando una pipeta e incuba a 37 °C durante 1 hora.
   10. Distribuye 500 μl de las células recuperadas sobre una placa de 20 x 20 cm cuadrados de LB que contiene 12,5 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de ampicilina. Incuba la placa a 30 °C durante 12 horas.
   11. Raspa las colonias usando un raspador de células y recoge las células en un tubo cónico de 50 ml utilizando un medio de almacenamiento celular helado.
   12. Centrifugar a 1.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Resuspender el pellet en 10 ml de medio de almacenamiento de celdas heladas para alcanzar un OD₆₀₀ de 100.
   13. Alícuota de 20 μl de las celdas para almacenamiento a −70 °C.
        
2. Eliminación de falsos positivos de la biblioteca metagenómica
   1. Descongelar las células biblioteca metagenómica estándar (del Paso 1.13) que contienen ADN metagenómico fosmid y pGESS(E135K) sobre hielo.
   2. Inocular 10 μl de las células en 2 ml LB que contienen 50 μg/ml de ampicilina y 12,5 μg/ml de cloranfenicol en un tubo de fondo redondeado de 14 ml. Incubar a 37 °C con agitación a 200 rpm durante 4 horas.
   3. Mientras tanto, enciende la máquina de clasificador de celdas activado por fluorescencia (FACS) y abre el software FACS por defecto. Utiliza los siguientes ajustes: diámetro de la punta de la boquilla, 70 μm; Sensibilidad al área de dispersión directa (FSC-A), amplificación V-logarítmica de 300; Sensibilidad del área de dispersión lateral (SSC-A), amplificación V-logarítmica de 350 grados; sensibilidad al área de isotiocianato de fluoresceína (FITC-A), amplificación 450 V-logarítmica; parámetro umbral, valor FSC-A 5.
      NOTA: Las configuraciones típicas se indican para el dispositivo FACS mencionadas en la Tabla de Materiales. Ajusta la configuración para otros dispositivos FACS.
   4. Diluir las células biblioteca metagenómica del Paso 2.2 añadiendo 5 μl de la muestra a un tubo de fondo redondo de 5 ml que contiene 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   5. Coloque la muestra de la biblioteca diluida en el puerto de carga del instrumento FACS y haga clic en el botón Cargar en el Panel de Adquisiciones del software FACS.
   6. Ajusta la tasa de eventos a 1.000 - 1.500 eventos/segundo haciendo clic y controlando los botones de Caudal en el panel de control.
   7. Crea diagrama de dispersión logarítmico FSC-A frente a escala logarítmica SSC-A en una hoja global haciendo clic en el botón Dot Plot en la barra de herramientas. Ajusta la puerta de dispersión R1 para abarcar los eventos singlete (población bacteriana) usando el botón Polygon Gate en la barra de herramientas.
   8. Grafica un histograma con el recuento de celdas frente al FITC-A escalado en logarítmic en la hoja haciendo clic en el botón Histograma. Luego, ajusta el voltaje FITC desde la pestaña de Configuración del Citómetro en la ventana de Control del Inspector de modo que el pico de la distribución en forma de campana sea menor que 10² de FITC-A.
   9. Crear una FSC-A a escala logarítmica vs. el registro FITC-A traza haciendo clic en el botón Dot Plot en la hoja global. Configura una puerta de clasificación R2 en la gráfica usando el botón de Puerta Polígona en la barra de herramientas para que la puerta esté situada entre +5% y -5% celdas del centro de la distribución (un total del 10% de celdas alrededor del pico de la curva en forma de campana).
   10. Coloca un tubo de recogida que contenga 1,2 ml LB con 50 μg/ml ampicilina y 12,5 μg/ml cloranfenicol en la salida del instrumento FACS y ordena 10⁶ celdas que cumplan tanto las compuertas R1 como R2.
   11. Quita el tubo de recogida, la tapa y el vórtice suavemente.
        
3. Cribado de enzimas metagenómicas
   1. Incubar las células clasificadas (del paso 2.11) a 37 °C con agitación a 200 rpm hasta que el OD₆₀₀ alcance 0,5.
   2. Añadir una solución de inducción de copia de 1 μl para amplificar el número de copias intracelulares de fosmid. Incubar las células durante 3 horas adicionales a 37 °C con agitación a 250 rpm.
   3. Para preparar las células para la clasificación, añadir 0,5 ml de las células cultivadas y un sustrato adecuado (p-nitrofenilacetato, p-nitrofenil-β-D-celulósido, o fenilfosfato) en un tubo de fondo redondeado de 14 ml a una concentración final de 100 μM.
      1. Para una muestra de control, añadir 0,5 ml de las células cultivadas del Paso 3.2 en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Añade el mismo volumen de PBS que el volumen del sustrato en el Paso 3.3.
   4. Incubar las dos muestras a 37 °C con agitación a 200 rpm durante 3 horas.
   5. Mientras tanto, prepara la máquina FACS con las mismas configuraciones que el Paso 2.3.
   6. Añadir 5 μl de las celdas (para clasificar) y las celdas de control a dos tubos de fondo redondo de 5 ml que contienen 1 ml PBS, respectivamente.
   7. Coloca el tubo que contiene las celdas de control en el puerto de carga del FACS y haz clic en el botón Load en el Panel de Adquisición del software FACS. Ajusta la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos/seg controlando los botones de Caudal en el panel de control.
   8. Crea diagrama de dispersión logarítmico FSC-A frente a SSC-A logarítmico haciendo clic en el botón Dot Plot en la hoja global del software, y ajusta la puerta de dispersión R1 para abarcar los eventos singlete (población bacteriana) usando el botón Polygon Gate en la barra de herramientas.
   9. Crea diagrama de dispersión FITC-A a escala logarítmica frente a FITC-A a escala logarítmica haciendo clic en el botón Dot Plot en la hoja de cálculo, y configura una puerta de clasificación R2 en el gráfico usando el botón Polygon Gate de la barra de herramientas para que menos del 0,1 % de las celdas negativas sean detectadas dentro de la puerta R2.
   10. Sustituye el tubo de muestra de control por el tubo de muestra de clasificación y ajusta la tasa de eventos a 1.000 - 3.000 eventos/seg controlando los botones de Caudal en el salpicadero.
   11. Coloca un tubo de recogida que contenga 0,5 ml LB en la salida del instrumento FACS y ordena 10^{celdas de 4} que satisfagan tanto las compuertas R1 como R2.
       NOTA: El criterio de clasificación puede variar desde el 0,1% superior hasta el 5% de FITC-A en la puerta R2. En este protocolo, el 1% superior de las células se recogió como positivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CopyControl	Epicentro	CCFOS110	Kit de producción de la biblioteca Fosmid
Solución de inducción CopyControl	Epicentro	CCIS125	Solución inductiva por copia de Fosmid
EPI300	Epicentro	EC300110	Celda electrocompetente
pCC1FOS	Epicentro	CCFOS110	Vector fosmid
Pulsador genético Mxcell	Bio-Rad		Cuveta de electroporación y sistema electroporado
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometría de flujo (máquina FACS)
AZ100M	Nikon		Microscopio
Ultraslim	Maestrogenos		Iluminador LED
Tubo cónico de 50 ml	BD Falcon
Tubo de fondo redondo de 14 ml	BD Falcon
Tubo de fondo redondo de 5 ml	BD Falcon
P-nitrofenilfosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Sustrato
p-nitrofenil β-D-celobiosido	Sigma-Aldrich	N5759	Sustrato
P-nitrofenilbutirato	Sigma-Aldrich	N9876	Sustrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, cloruro de sodio 10 g/L
Caldo súper óptimo (SOB)	BD Difco	244310	Triptona 20 g/L, extracto de levadura 5 g/L, cloruro de sodio 0,5 g/L, sulfato de magnesio 2,4 g/L, cloruro de potasio 186 mg/L
Caldo súper óptimo con represión catabólica (SOC)		SOB, 0,4 % de glucosa
2x extracto de levadura triptona (2xYT)	BD Difco	244020	Digestión pancreática de caseína 16 g/L, extracto de levadura 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L
Medios de almacenamiento celulares			2 veces caldo YT, 15% glicerol, 2% glucosa
pGESS(E135K)			Un vector de ADN que contiene dmpR, genes egfp con sus promotores correspondientes, RBS y terminador. Consulta la referencia 5 en el manuscrito para más detalles.
Cloranfenicol	Sigma	C0378
Ampicilina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Software de Citometría de Flujo Versión 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% fosfato disódico, 0,024% fosfato monopotásico, pH 7,4