In vitro Modelo de cultivo por lotes para imitar la fermentación del colon por microbiota intestinal humana

Resumen

Fuente: Ahmadi, S., et al. Un modelo de cultivo lotado in vitro para estimar los efectos de los regímenes intervencionistas sobre la microbiota fecal humana. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demuestra un método para modelar la fermentación microbiana intestinal incubando muestras de heces con fibra fermentable dietética bajo condiciones anaeróbias para estudiar la producción de metabolitos por microbiota intestinal.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recogida de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

CAUTELA: Consulte las Hojas de Datos de Seguridad de Materiales correspondientes y siga las instrucciones y directrices para la formación adecuada en Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2). Sigue todos los pasos de cultivo según las normas estándar de bioseguridad y utiliza un armario BSL-2 en condiciones asépticas. Además, las muestras fecales de diferentes modelos y sujetos humanos pueden presentar un riesgo potencial de propagación de enfermedades transmitidas por microbianos. Busca ayuda médica inmediatamente en caso de cualquier lesión o infección. Además, el uso de muestras de heces humanas y animales debe ser aprobado por comités éticos institucionales y debe cumplir con los protocolos para el uso de muestras e información del sujeto.

1. Preparación de medios culturales

1. Preparación del medio de cultivo, preparar nueve tipos de soluciones de stock:
   1. Solución A (1.000 mL): Disolver 5,4 g de cloruro de sodio (NaCl), 2,7 g de dihidrógeno fosfato potásico (KH₂PO₄), 0,16 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl 2,2H₂O), 0,12 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl_{2,6H 2}O), 0,06 g de cloruro de manganeso tetrahidrato (MnCl_{2,4H 2}O), 0,06 g de cloruro cobaltoso hexahidrato (CoCl_{2,6H 2}O) y 5,4 g de sulfato de amonio (NH₄)2SO₄, en agua desionizada para alcanzar un volumen total de 1.000 mL.
   2. Solución B (1.000 mL): Disuelva 2,7 g de fosfato de hidrógeno potásico (K_{2HPO 4}) en agua desionizada para alcanzar un volumen total de 1000 mL.
   3. Solución de minerales traza (1.000 mL): Disolver 500 mg de dihidrato de etilenodiamina-tetraacetato dissódico (Na₂EDTA), 200 mg de sulfato ferroso heptahidrato (FeSO_{4,7H 2}O), 10 mg de sulfato de zinc heptahidrato (ZnSO 4,7H₂O), 3 mg de cloruro de manganeso(II) tetrahidrato (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg de ácido fosfórico (H₃PO₄), 20 mg de CoCl 2,6H ₂O, 1 mg de cloruro cústrico dihidrato (CuCl 2,2H₂O), 2 mg de cloruro de níquel(II) hexahidrato (NiCl_{2,6H 2}O) y 3 mg de molibdato de sodio dihidratado (Na₂MoO_{4,2H 2}O) en agua desionizada para alcanzar el volumen total de 1.000 mL.
      NOTA: Esta solución es sensible a la luz, por lo que asegúrate de almacenarse en tubos/botellas oscuras/negras o envueltas en aluminio.
   4. Solución vitamínica soluble en agua (1.000 mL): Disuelva 100 mg de tiamina clorhidrato (Tiamina-HCl), 100 mg de ácido D-pantoténico, 100 mg de niacina, 100 mg de piridoxina, 5 mg de ácido P-aminobenzoico y 0,25 mg de vitamina B12 en agua desionizada para alcanzar un volumen total de 1.000 mL.
   5. Folato: solución de biotina (1.000 mL): Disuelve 10 mg de ácido fólico, 2 mg de D-biotina y 100 mg de bicarbonato de amonio (NH_{4HCO 3}) en agua desionizada para obtener un volumen total de 1.000 mL.
   6. Solución de riboflavina (1.000 mL): Disolver 10 mg de riboflavina en 5 mM de solución HEPES (4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanosulfónico) (1,19 g/L) para obtener un volumen total de 1.000 mL.
   7. Solución de hemín (10 mL): Disuelva 5.000 mg de hemín en una solución de hidróxido de sodio (NaOH) (0,4 g/L) de 10 mM para alcanzar el volumen total de 10 mL.
   8. Mezcla de ácidos grasos de cadena corta (10 mL): Combinar 2,5 mL de N-valerato, 2,5 mL de isovalerato, 2,5 mL de isobutirato y 2,5 mL: DL-α-metilbutirato.
      NOTA: Esta solución se recomienda usar en una campana extractora para evitar el olor y los vapores.
   9. Resazurina (1.000 mL): Disuelve 1 g de resazurina en agua desionizada y haz que el volumen total sea de 1.000 mL.
2. Medio utilizado para la fermentación anaeróbica in vitro
   1. Para preparar este medio, mezcla 330 mL de Solución A, 330 mL de Solución B, 10 mL de solución de minerales traza, 20 mL de solución vitamínica soluble en agua, 5 mL de folato: solución de biotina y 5 mL de solución de riboflavina; 2,5 mL de solución de hemina, 0,4 mL de mezcla de ácidos grasos de cadena corta, 1 mL de Resazurina, 0,5 g de extracto de levadura, 4 g de carbonato de sodio (Na₂CO₃), 0,5 g de cisteína HCl-H_2Oy 0,5 g de tripticasa, y añadir 296,1 mL de agua destilada.
   2. Comproba el pH y asegúrate de que esté alrededor de 7,0; si no, ajusta el pH con 1 N HCl o 1 N NaOH. Esterilizara filtrando el medio al vacío usando un filtro de botella bajo la estación de trabajo aséptica.
   3. Alternativamente, mezcla todos los componentes (excepto las vitaminas y las soluciones de hemin) y el autoclave a 121 °C durante 20 minutos y deja que se enfríe hasta la temperatura ambiente. Simultáneamente, filtrar y esterilizar las soluciones de vitaminas y hemíns usando filtros de membrana de 0,22 μm y añadirlas al medio autoclavado y refrigerado antes de dispensarlas.

2. Preparación de la cámara anaeróbica y materiales necesarios

1. Guarda todos los materiales, soluciones y herramientas necesarias para el experimento de fermentación dentro de la cámara anaeróbica al menos 48 horas antes del inicio del experimento, para asegurarte de que cualquier oxígeno residual asociado a las herramientas y oxígeno soluble en tampones/soluciones se elimine y que todos los materiales se aclimaten a las condiciones anaeróbicas establecidas.
   NOTA: Materiales necesarios dentro de la cámara anaeróbica (48 horas antes del experimento para comenzar): (i) medios de fermentación; (ii) solución anaeróbica (preparada según la sección 4.1), (iii) vortexer, (iv) balanza, (v) mantellas de muselina, (vi) tijeras, (vii) embudo, (viii) tubos de 1,5, 2,0, 15, 50 mL, (ix) pipetistas (2, 20, 200 y 1.000 μL) y puntas de pipeta compatibles, (x) pajita de pistola y filetas (5 y 10 mL), (xi) pañuelos de papel, (xii) marcadores, (xiii) soportes para tubos diferentes, (xiv) caja de residuos, (xv) indicador de O2 y (xvi) pulverizador de etanol al 70% (desinfectante).

3. Preparación de tubos y fibras

1. Pesa 300 mg de inulina y transfiere a un tubo de 50 mL, seguido de la adición aséptica de 26 mL de medio de fermentación ya preparado y almacenado en la cámara anaeróbia. Preparar un tubo en blanco para cada tipo de muestra fecal y cada tubo experimental (según el número de compuestos analizados), en triplicado.
2. Deja estos tubos dentro de la cámara anaeróbica durante unas 24 horas para permitir la hidratación de las muestras antes de comenzar el experimento de fermentación. Asegúrate de que la temperatura del tubo sea de 37 °C en el momento de la inoculación, por lo que los tubos de la incubadora estén encerrados dentro de la cámara anaeróbica.

4. Preparación del inóculo

1. Solución anaeróbica de dilución (al menos 48 h antes del experimento de fermentación): Disuelva 5 g de NaCl, 2 g de glucosa y 0,3 g de Cisteína-HCl en agua desionizada y alcanza el volumen total de 1.000 mL. Autoclave y guárdalo dentro de la cámara anaeróbica al menos 48 horas antes de su uso.
2. Preparación del inoculo fecal (en el día del experimento de fermentación): Pesar 5 g de muestra fecal fresca en un tubo cónico de 50 mL, añadir solución de dilución anaeróbica para un volumen final de 50 mL (1:10 p/v) y usar el vórtice durante 15 minutos o hasta que esté completamente homogeneizada. Filtra la mezcla homogeneizada a través de 4 capas de gasa estéril (autoclaveada) y úsala inmediatamente para inocular en los tubos que contienen el medio.
   NOTA: Las muestras fecales de un grupo de sujetos pueden agruparse si el objetivo experimental es comparar el efecto de un compuesto o ingrediente dado sobre la microbiota fecal general sana frente a la enferma en general.

5. Fermentación y muestreo

1. Preparar los tubos según la sección 4.2 e inocular los tubos en blanco/control y experimental con 4 mL de inóculo fecal diluido y filtrado. Incubar los tubos inoculados a 37 °C dentro de la cámara anaeróbia. Sacude los tubos una vez cada hora invirtiendo suavemente para volver a suspender las fibras y el inóculo.
2. Recoge muestras con la frecuencia que necesites, por ejemplo, cada hora hasta 0, 3, 6, 9 y 24 horas durante la fermentación, extrayendo una muestra de 2 mL de alicota en un tubo de 2 mL de los respectivos tubos de fermentación.
3. Mide el pH de las alicuotas usando un medidor de pH de laboratorio (insertando directamente el electrodo de pH en la muestra); centrifugar la muestra restante a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Congelar inmediatamente el sobrenadante y el pellet en nitrógeno líquido y, tras congelar rápidamente, almacenar el sobrenadante para el análisis de SCFAs (ácidos grasos de cadena corta) y el pellet para el análisis del microbioma a -80 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	217255
Sulfato de amonio	TGI	C2388	Nocivo
Dihidrato de cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C3306	Irritante
Cloruro cobaltoso hexahidrato	Sigma-Aldrich	255599
Dihidrato de cloruro cúprico	Acros orgánicos	2063450000	Tóxico, irritante
Cisteína-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotina	Sigma-Aldrich	B4501
Ácido D-Pantoténico	Alfa Aesar	A16609
Dihidrato dihidrato de etilendediamina, tetraacetato	Biorad	1610729
DL-α-metilbutirato	Sigma-Aldrich	W271918
Sulfato ferroso heptahidratado	Sigma-Aldrich	F8263	Nocivo
Ácido fólico	Alfa Aesar	J62937
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
Hemina	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutirato	Alfa Aesar	L04038
Isovalato	Alfa Aesar	A18642
Cloruro de magnesio hexahidrato	Sigma-Aldrich	M8266
Tetrahidrato de cloruro de manganeso	Sigma-Aldrich	221279
Niacina (ácido nicotínico)	Sigma-Aldrich	N4126
Cloruro de níquel(II) hexahidrato	Alfa Aesar	A14366	Nocivo
N-valerato	Sigma-Aldrich	240370
Ácido P-aminobenzoico	MP China	102569	Tóxico, irritante
Ácido fosfórico	Sigma-Aldrich	P5811
Dihidrógeno fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P5504
Fosfato de hidrógeno potásico	Sigma-Aldrich	1551128
Piridoxina	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavina	Alfa Aesar	A11764
Sosa	Sigma-Aldrich	1613757
Cloruro de sodio	Biorreactivos de Fisher	7647-14-5
Hidróxido sódico	Fisher Chemicals	S320
Molibdato sódico dihidratado	Acros orgánicos	206375000
Clorhidrato de tiamina	Acros orgánicos	148991000
Tripticasa	BD Biociencias	211921
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	70161
Sulfato de zinc heptahidrato	Sigma-Aldrich	Z0251
Filtro de membrana de 0,22 μm
Cuentas magnéticas de purificación AMPure	Agencourt
Cámara anaeróbica con incubador	Sistema anaerobiano forma, Thermo Scientific, EE. UU.
Filtro de botella	Corning
Estameña
Medidor de pH
Vórtice	Termociencia