Fermentación microaeróbica del hidrolizado de bambú por Klebsiella pneumoniae

Resumen

Fuente: Wei, D., et al., Producción de productos químicos por Klebsiella pneumoniae utilizando hidrolizado de bambú como materia prima. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra la conversión microbiana de azúcares derivados del bambú en 2,3-butanediol mediante el cultivo de Klebsiella pneumoniae en un medio basado en hidrolizado bajo condiciones microaeróbicas y ligeramente ácidas.

Protocolo

1. 2,3-Butanediol Producción por K. pneumoniae de tipo salvaje

1. Utiliza 3 litros de hidrolizado de bambú como disolvente para la preparación del medio.
2. Preparar un medio de fermentación que contenga 4 g/L de licor en infusion de maíz, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K_{2HPO 4}, 3 g/L_{KH 2}PO₄ y 0,2 g/L_{MgSO 4}. Ajusta el pH del medio a neutro usando 2,5 M de NaOH. Utiliza un biorreactor de 5 L que contenga 3 L de medio de fermentación autoclavado para la fermentación.
3. Utiliza células de K. pneumoniae almacenadas en un frigorífico a baja temperatura a -80°C.
4. Para el cultivo de semillas, incubar un matraz de 250 mL que contenga 50 mL de medio Luria-Bertani (LB) durante la noche a 37 °C, agitando a 200 rpm. Utiliza un medio LB que contenga 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl. NOTA: La densidad celular del cultivo de semillas debería alcanzar OD 2 (densidad óptica a 600 nm).
5. Inocular un matraz de 50 mL de cultivo de semillas en el biorreactor. Mantener el cultivo a pH 6,0 y 37 °C. Utilizar una tasa de suplementación con aire de 2 L/min y una velocidad de agitación de 250 rpm, creando una condición microaeróbica.
6. Recoge 5 mL de muestras cada 2 horas durante la fermentación y analízalas con cromatografía líquida a alta presión para determinar las concentraciones químicas en el caldo.
7. Monitoriza el álcali añadido al biorreactor en línea usando sistemas de pila de combustible microbiana/adquisición de datos o MFCS/DA.
   NOTA: Se producen ácidos orgánicos durante el proceso de fermentación y se añade NaOH para mantener estable el pH del cultivo. El volumen de álcalis añadido representa la cantidad de ácido producida. Cuando la línea añadida por álcali se estanca, el proceso termina, ya sea por agotamiento de la fuente de carbono o por muerte celular.

2. Producción de R-acetoína por el mutante budC de K. pneumoniae

1. Preparar un medio para la producción de acetoína que contenga 4 g/L de licor en infusion de maíz, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L de acetato sódico, 0,4 g/L de KCl y 0,1 g/L de_{MgSO 4}.
2. Utiliza K. pneumoniae-ΔbudC para la producción de R-acetoína. Repite los pasos 1.4-1.5.
   NOTA: budC codifica 2,3-butanediol deshidrogenasa. K. pneumoniae-ΔbudC pierde la actividad de 2,3-butanediol deshidrogenasa y produce R-acetoína en lugar de 2,3-butanediol.
3. Mantenga el cultivo a pH 6,0 y 37 °C. Utilice una tasa de suplementación con aire de 4 L/min y una frecuencia de agitación de 450 rpm, una condición aeróbica.
   NOTA: La suplementación con oxígeno es superior a la producción de 2,3-butanediol.
4. Analiza las muestras como en el paso 1.6.

3. Producción de ácido 2-cetoglucónico por el mutante budA de K. pneumoniae

1. Para la producción de ácido 2-cetoglucónico, utiliza el mismo medio que para la producción de R-acetoína.
2. Utiliza K. pneumoniae-ΔbudA para la producción de ácido 2-cetoglucónico. Repite los pasos 1.4-1.5.
   NOTA: budA codifica α-acetolactato descarboxilasa. K. pneumoniae-ΔbudA pierde la actividad de la descarboxilasa de α-acetolactato y produce ácido 2-cetoglucónico, utilizando la glucosa como sustrato.
   NOTA: La síntesis de ácido 2-cetoglucónico es un proceso dependiente de la condición ácida. Se ha desarrollado una fermentación en dos etapas para la producción de ácido 2-cetoglucónico; En la primera etapa, el cultivo de semillas se inocular en el biorreactor.
3. Mantenga el cultivo a pH 7,0 y 37 °C. Utilice una tasa de suplementación con aire de 4 L/min y una tasa de agitación de 500 rpm.
   NOTA: En estas condiciones, las células crecen muy rápido (la densidad celular alcanza OD 7 en unas 4 horas). Luego, la fermentación avanza a la segunda etapa, durante la cual el pH del cultivo disminuye hasta 5,0. No se añade ácido; los ácidos orgánicos producidos en el cultivo conducen naturalmente a una disminución del pH. En estas condiciones ácidas, el crecimiento celular se detiene, pero el ácido 2-cetoglucónico se sintetiza y se acumula en el caldo.
4. Analiza las muestras como en el paso 1.6. Usando el hidrolizado de bambú como fuente de carbono.
   NOTA: La glucosa del medio se convierte en ácido 2-cetoglucónico, y la xilosa se convierte en ácido xilónico. Así, se obtiene una mezcla de ácido 2-cetoglucónico y ácido xilónico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Autoclave	SANYO	3780
Biorreactor	Sartorius Stedim biotecnología	Bostat Aplus
Agitador	IKA	RW 20
Sistema de cromatógrafo líquido de alto rendimiento	Shimadzu Corp	20AVP
Polvo de bambú	Comprado en la provincia de Zhejiang, China		Número de malla, 50
Celulasa	Youtell Biochemical, Shandong, China		200 PFU/mL