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1. Extracción de metabolitos
- Descongelan muestras sobre hielo húmedo y alteran las células en un homogeneizador con cuatro ráfagas de 30 s a 6.000 rpm, con períodos de enfriamiento de 2 minutos sobre hielo seco entre ciclos.
- Clarifica los lisados durante 15 minutos en una microcentrífuga refrigerada y preenfriada a máxima velocidad (es decir, 18.213 x g a ≤4 °C).
- Transfiere el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
- Utilizando una micropipeta, transfiere una pequeña porción de la muestra a un tubo microcentrífuga para cuantificar el contenido residual de peptídicos en el paso 2; almacenar el resto a -80 °C.
NOTA: El volumen de la muestra reservada varía según el ensayo de ácido bicincónico (BCA) utilizado en el paso 2.1. Esta muestra debe almacenarse sobre hielo húmedo para su análisis inmediato o congelarse a -80 °C.
2. Ensayo de ácido bicinquinínico (BCA)
- Realizar un ensayo BCA según lo recomendado por el fabricante del kit, utilizando muestras del paso 1.4 para determinar la concentración residual de péptidos para cada muestra.
3. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)
- Mezclar 75 μL de extracto de Staphylococcus aureus (S. aureus) con 75 μL de disolvente LC-MS B, preparado en el paso 1.4.
- Vórtice para mezclar y centrifugar a 13.000 x g durante 5 minutos.
- Coloque 100 μL de sobrenadante en un vial de cromatografía líquida (LC) y cipéalo. Asegúrate de que no queden burbujas de aire atrapadas en la muestra.
- Carga los viales LC en el autosampler LC-MS y edita la lista en ejecución en el software "Offline Worklist Editor".
- Rellena las columnas "Nombre de muestra" (por ejemplo, tipo comodín 1), "Posición de muestra" (por ejemplo, P1-A1), "Método" (por ejemplo, Método Ácido Fórmico Negativo) y "Archivo de datos" (por ejemplo, tipo salvaje 1). Haz clic en el botón "Guardar lista de trabajo". Abre el software "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" e introduce la lista de trabajo guardada anteriormente. Haz clic en el botón "Iniciar Ejecutar la lista de trabajo" para iniciar la medición continua de LC-MS.
- Separa las muestras en una columna, enlaza la columna con un espectrómetro de tiempo de vuelo (TOF) y acopla el espectrómetro TOF con el sistema LC. Utiliza un gradiente de fase móvil de la siguiente manera: 0-2 min, 85% disolvente B; 3-5 minutos, 80% disolvente B; 6-7 minutos, 75% disolvente B; 8-9 minutos, 70% disolvente B; 10-11,1 min, 50% disolvente B; 11,1-14 min, 20% disolvente B; y 14,1-24 min, 5% disolvente B; finalizando con un periodo de reequilibrio de 10 minutos al 85% de disolvente B y un caudal de 0,4 mL min-1.
- Utilizando una bomba isocrática, infundir una solución de masa de referencia en la pista para permitir la calibración simultánea del eje de masa.
NOTA: Este paso se basa en el manual estándar del espectrómetro TOF.- Utiliza la mezcla de ácido acético D4 y fosfasia hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) como solución de masa de referencia para realizar la calibración en tiempo real. Utiliza la bomba isocrática con un caudal de 2,5 mL min-1 para la infusión.
4. Corrección por lotes de recuento de iones
- Designa cualquier muestra para que sirva como muestra de referencia para la corrección por lotes (por ejemplo, wild-type, replicate 1).
- Calcula la suma de los recuentos iónicos de todos los metabolitos dentro de la muestra de referencia. Repite este cálculo para todas las muestras.
- Divide el recuento total de iones de cada muestra entre el recuento total de iones de la muestra de referencia para generar una razón.
- Divide el recuento de iones de cada metabolito dentro de una muestra entre la proporción muestra/referencia para obtener un recuento de iones corregido por lotes para cada metabolito.
5. Normalización de péptidos
- Divide los valores de recuento de iones corregidos por lotes para cada muestra obtenida en el paso 4 por la concentración de peptídeos determinada con el ensayo BCA en el paso 2 para obtener un valor normalizado para cada metabolito.
NOTA: Los recuentos iónicos normalizados y corregidos por lotes para cada metabolito obtenidos en el paso 5.1 pueden compararse directamente entre cepas y someterse a un análisis estadístico (por ejemplo, una prueba U de Mann-Whitney). Alternativamente, un metabolito conocido por no haber cambiado ya sea por el tratamiento o por el fondo genético puede utilizarse como normalizador para detectar cambios debidos a la descomposición del metabolito. La inclusión de una cantidad conocida de L-norvalina o ácido glutárico en el tampón de extracción puede utilizarse para corregir la pérdida durante el procesamiento de muestras.