Monitorización del crecimiento bacteriano en formulaciones de medios distintos con un microbioractor automatizado

Resumen

Fuente: Hemmerich, J., et al. Protocolo para la optimización de la producción de proteínas heterólogas utilizando tecnología automatizada de microbioreadores. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demuestra el uso de un microbioreactor automatizado para monitorizar el crecimiento bacteriano y la secreción de proteínas fluorescentes en respuesta a diferentes formulaciones de medios. Una bacteria genéticamente modificada que expresa una proteína fluorescente secretora se cultiva bajo selección antibiótica y se inocula en pozos de variación nutricional. Las mediciones ópticas en tiempo real de la densidad y fluorescencia celular permiten un análisis comparativo de la producción de proteínas a través de diferentes condiciones de crecimiento.

Protocolo

1. Preparación de materiales y procedimientos de definición
NOTA: Se recomienda definir y fijar los métodos experimentales a un nivel detallado. Esta estandarización garantiza que diferentes resultados puedan rastrearse hasta la variabilidad biológica intrínseca o diferentes composiciones de medios. ​
NOTA: Soluciones de stock para medios: Prepara soluciones individuales para todos los componentes de medios investigados. Prepara stocks altamente concentrados para permitir la dilución de diferentes volúmenes para todos los componentes. Esto significa que, tras combinar todas las soluciones de stock en su máximo volumen según el plan de diseño, esto no puede superar el volumen final de cultivo, véase el párrafo "Generación de la lista de pipeteo de soluciones medias de stock" paso 1.3.3. Si la adición de una solución altamente concentrada resulta en un volumen de adición muy bajo, por ejemplo, < 1/100 del volumen final de cultivo, diluir la solución stock en consecuencia. Por ejemplo, en este estudio, se definió que un volumen de pipeteo inferior a 10 μL era inviable. Normalmente, las soluciones de elementos traza se concentran hasta 1.000 veces más que la concentración estándar final en el medio. Es ventajoso concentrar los componentes del medio como múltiplos (X-multiplices) respecto a las concentraciones en la receta de referencia. De este modo, se evitan volúmenes inviables de pipeteo de decimales fraccionarios. Las recetas detalladas para todas las soluciones estándar del medio CgXII se ofrecen en el documento suplementario.

1. Banco de celdas de funcionamiento (WCB)
Nota: Para cada experimento de crecimiento, se utiliza una alitera WCB. Si se necesitan más alicuotas, utiliza un medio de infusión cardíaca cerebral (BHI) de 100 mL en frascos de batido con defletores de 1.000 mL o inocular varios frascos de batido, que se agrupan antes de añadir la solución de glicerol.

1. Preparar colonias individuales de la cepa de expresión recombinante C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 en placas de agar (37 g/L de polvo de BHI, 20 g/L de agar, 25 mg/L de kanamicina). El material de recubrimiento puede provenir de una transformación reciente o de una alicota criopreservada. Incubar a 30 °C hasta la aparición de colonias individuales; Esto suele tardar de uno a dos días.
2. Inocular un cultivo en matraz agitador (medio BHI de 50 mL con 25 mg/L de kanamicina, matraz con 500 mL de defletor, 250 rpm, diámetro de agitación de 25 mm, 30 °C) con material de colonia e incubar durante la noche (aproximadamente 16 h).
3. Combinar un volumen de la suspensión celular resultante con un volumen de solución estéril de glicerol de 500 g/L y distribuir en 2 mL de alicotas en viales estériles de criopreservación. Guarda a -80 °C.

2. Protocolo de cultivo MBR
Nota: Para el sistema BioLector MBR empleado en este estudio, la luz dispersada (biomasa) y la fluorescencia GFP son mediciones de intensidad, que requieren asignar un determinado valor de ganancia. Cuanto mayor es la ganancia, mayor se amplifica la señal óptica; Por eso también se miden la luz dispersada y la fluorescencia en unidades arbitrarias (u.a.). Determinar valores de ganancia adecuados para la detección de biomasa y GFP en experimentos preliminares, junto con la frecuencia de agitación y el volumen de llenado adecuados para evitar limitaciones de oxígeno en concentraciones más altas de biomasa durante las etapas posteriores del proceso. Las condiciones de cultivo empleadas ("Placas florales", es decir, MTPs en forma de flor de 48 pozos, frecuencia de agitación de 1.200 rpm, volumen de llenado de 1.000 μL, 10 g/L de glucosa como principal fuente de carbono) aseguraron cultivos ilimitados al oxígeno. Para obtener las máximas tasas de transferencia de oxígeno derivadas de otras combinaciones de volúmenes de llenado y frecuencias de agitación en MTPs de 48 pozos en forma de flor, hay hojas de datos disponibles del proveedor. Además, pueden aparecer defectos de crecimiento en cultivos individuales debido a bajas cantidades de sustratos secundarios (por ejemplo, nitrógeno, oligoelementos). Por lo tanto, comprueba las concentraciones de biomasa al final del cultivo. En este estudio no se observaron tales efectos de crecimiento.

1. Defina el protocolo de cultivo para el sistema MBR ("BioLector") de la siguiente manera:
2. Conjunto de filtros 1: Biomasa, ganancia 14. Filtro 2: pH, ganancia preestablecida. Filtro 3: pO2, ganancia preestablecida. 4: GFP, ganancia 80.
3. Frecuencia de vibración: 1.200 rpm.
4. Temperatura: 30 °C.
5. Tiempo de ciclo: 15 min.
6. Tiempo de experimento: manual (La cultivación no se detendrá automáticamente).

3. Generación de lista de pipeteo por solución media
Nota: Casi cualquier sistema de robot para manipular líquidos es capaz de leer acciones de pipeteo desde archivos externos. Básicamente, la información mínima necesaria es el volumen de transferencia y la posición de la fuente del reactivo, así como el destino de cada uno representado por una posición de material de laboratorio en la cubierta robótica y una cavidad específica dentro del material de laboratorio. Sin embargo, deben considerarse diferentes sintaxis para distintos sistemas de manipulación de líquidos. La Figura 1 muestra una estructura de archivos de ejemplo para el sistema de pipeteo empleado en este estudio.

1. Se pipetean cuatro tipos de soluciones de material en cada pozo de cultivo:

1. Soluciones de stock de componentes de medios que son variados ("Variaciones de Acciones").
2. Agua para compensar los diferentes volúmenes acumulados de las existencias mencionadas.
3. Una solución estándar ("Stock de descanso") que contiene todos los componentes fijos. Esta solución de material puede estar compuesta por fondos que contienen los diferentes componentes que, por ejemplo, se almacenan a diferentes temperaturas o se esterilizan mediante distintos métodos.
4. Inóculo, que debe añadirse como último componente y colocarse sobre la mesa de trabajo justo antes de añadirlo para evitar que las células se asienten.

2. Por pozo de cultivo, calcular los volúmenes a transferir para todos los componentes del medio según ello:

El volumen que se va a añadir para ciertas acciones de variación puede ser cero, es decir, cuando se omite este componente específico.

3. Revisar todos los volúmenes calculados Vi para obtener números adecuados. Los incrementos de volumen en los pasos de volumen no deben ser demasiado pequeños. Si es necesario, ajusta la concentración de acciones de variación. Por ejemplo, el volumen mínimo de pipeteo aquí se definió como 10 μL, y el incremento mínimo se definió como 5 μL. En general, estos volúmenes deben definirse en función de la precisión y exactitud experimentalmente determinadas para la estación de manipulación de líquidos utilizada.

4. Calcular el volumen del Stock de Reposo que contiene los componentes fijos de todos los pozos de la siguiente manera:

donde se utiliza el volumen máximo acumulado de Stock de Variación. En consecuencia, calcular las concentraciones requeridas de los componentes fijos en el Stock de Reposo de la siguiente manera:

Prepara el resto del stock en consecuencia.

5. Por pozo de cultivo, calcular el volumen de agua a añadir de la siguiente manera:

6. Por pozo de cultivo, enumerar todos los volúmenes a añadir en el siguiente orden de adición: V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Formatea la lista de pipeteo según las especificaciones de la estación de manipulación de líquidos, como se muestra por ejemplo en la Figura 1.

2. Cultivo de semillas, preparación automatizada de medios y inicio de la cultura principal

1. Crea un protocolo para el robot de manipulación de líquidos. Véase la Figura 2 y la Figura 3 para un protocolo de ejemplo para un sistema "Janus", implementado en el software correspondiente "WinPREP". El protocolo debe considerar los siguientes aspectos:

1. Incluir un tiempo suficiente de alojamiento estéril antes de la preparación para los medios.

2. Incluir una limpieza y lavado excesivo inicial de todas las puntas y tubos de pipetaje.

3. Elegir recipientes adecuados para material de laboratorio para soluciones de stock. Aquí, placas de pozo profundo con 12 columnas son adecuadas para el almacenamiento de Variaciones, ya que las ocho puntas de pipeteo pueden sumergirse en disposición paralela dentro de las columnas del pozo. Esto acelera enormemente la preparación de los medios. Si se utilizan tubos de reactivo de 15 mL o 50 mL como depósitos, solo una punta de pipeteo puede sumergirse en ella a la vez. Para otros materiales como agua y stock de reposo, se utilizan canaletas de 100 mL, ya que estas soluciones requieren mayores volúmenes en total.

4. Proporcionar un volumen total suficiente para cada solución de stock para compensar los volúmenes de residuos, alturas, desplazamientos de pipetado, etc.

5. Insertar una indicación del usuario antes del paso de inoculación, asegurando que este paso se realice inmediatamente antes del procedimiento de cultivo de semillas.

2. Preparar todas las soluciones de stock de forma estéril y almacenarlas hasta su uso, en recipientes apropiados, por ejemplo, tubos de ensayo estériles de 15 mL y 50 mL.
3. Esteriliza las placas profundas del pozo para almacenar soluciones en stock sobre una mesa de trabajo, por ejemplo, limpiando con etanol al 70% y secando posteriormente en una campana laminar.
4. Comienza el cultivo de semillas inoculando un medio BHI de 50 mL que contiene 25 mg/L de kanamicina con una alicuota del WCB. Antes del cultivo de MBR, preparar un inóculo fresco y vital a partir de cultivos de semillas que crecen exponencialmente en cantidad suficiente.
5. Coloca todo el material de laboratorio necesario sobre la mesa de trabajo robótica y vierte las soluciones de stock en el material correspondiente.
6. Inicia el flujo de trabajo robótico para la preparación del medio, de modo que el último paso (inoculación) se alcance a tiempo con el inicio del cultivo de semillas. El tiempo total de ejecución del flujo de trabajo robótico debe evaluarse de antemano. Aquí, la duración total era de aproximadamente 1,5 h.
7. Muestrea el cultivo de semillas aproximadamente 2 horas, y luego cada hora, para monitorizar el crecimiento por densidad óptica (OD₆₀₀). Tras aproximadamente 5 horas, el cultivo alcanza 3-4 OD₆₀₀ y se utiliza para inocular los cultivos principales.
8. Coloca el cultivo de semillas sobre la mesa de trabajo del manipulador de líquidos y continúa con el protocolo de preparación del medio. Cultivo de sello MTP tras la inoculación.
9. Coloca el MTP de cultivo sellado en el dispositivo BioLector y comienza el protocolo de cultivo predefinido.
10. Deshazte de las soluciones restantes, conforme a la normativa de bioseguridad si es necesario, y siembra el cultivo desde la mesa de trabajo robótica. Limpia el material de laboratorio reutilizable y comienza el protocolo de descontaminación del manipulador de líquidos.

Resultados

Figura 1: Captura de pantalla de la lista de pipeteo de volumen para análisis de sensibilidad. Las entradas de la primera columna asignan un identificador único a todos los volúmenes de una fila; este identificador es el número de pozo MTP ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Placa de flores	M2P-Labs	MTP-48-BOH	Para cultivo en el dispositivo BioLector
Papel de sellado	M2P-Labs	F-GP-10	Sellado estéril para Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	N/D	Disponible gratuitamente, instalación de MATLAB requerida
Robot pipeteador Janus	Perkin Elmer	N/D	Incluye la instalación del software "WinPrep"
Microplaca de pozo profundo de 12 columnas	E&K Scientific	EK-2034	Contenedor para soluciones de material medio
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	N/D	N/D	Lleva plásmido pEKEx2 con fusión del gen GFP y el péptido señal PhoD de B.subtilis como inserto de expresión. El plásmido proporciona resistencia a la kanamicina. Descrito y publicado por Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)