Criopreservación a largo plazo de cepas cianobacterianas utilizando glicerol o dimetilsulfóxido

Resumen

Fuente: Lea-Smith, D. J., et al. Generación de mutantes marcados y sin marcadores en especies modelo de cianobacterias. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demuestra la criopreservación de cepas cianobacterianas combinando suspensiones celulares concentradas con glicerol o DMSO y almacenándolas a bajas temperaturas, permitiendo el mantenimiento a largo plazo de cultivos viables para la fotosíntesis y estudios genéticos.

Protocolo

1. Preparación de medios culturales

1. Preparar BG11 medium
   1. Preparar soluciones de material de 100x BG11, elementos traza y material de hierro (Tabla 1).
   2. Preparar soluciones separadas de material fosfato, carbonato de sodio (Na₂CO₃) stock de N-[Tris(hidroximetil)metilo] -2-aminoetanol (TES) tampón y bicarbonato de sodio (NaHCO₃) (Tabla 1).
   3. Autoclave de las reservas de fosfato y Na₂CO₃ . Filtrar el tampón TES y_{NaHCO 3} con filtros de 0,2 μm.
   4. Prepara BG11 combinando 976 ml de agua, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos y 1 ml de hierro y autoclave de la solución. Después de que esta solución se haya enfriado a temperatura ambiente, añade 1 ml de fondo de fosfato, 1 ml_{de fondo de} Na₂CO 3 y 10 ml de NaHCO₃.
   5. Para el medio sólido BG11, añade 15 g de agar y 700 ml de agua a un matraz. En el segundo matraz, añade 3 g de tiosulfato de sodio (Na₂S₂O₃), 226 ml de agua, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos y 1 ml de caldo de hierro. Autoclave ambas soluciones. Después de que estas soluciones se hayan enfriado a temperatura ambiente, combínalas y añade 1 ml de fondo de fosfato, 1 ml de fondo de Na₂CO₃ , 10 ml de tampón TES y 10 ml de_{NaHCO 3}.
      NOTA: Las soluciones se preparan por separado para evitar la precipitación de ciertas sales.
2. Para la selección de sacarosa, prepara una solución de sacarosa al 50% (p/v). Filtrar, esterilizar la solución con filtros de 0,2 μm y añadir a BG11 (100 ml de sacarosa al 50% a 900 ml de BG11) para obtener placas de BG11/5% de sacarosa.
   NOTA: No añadas NaHCO₃ a placas de agar de sacarosa BG11/5%. Añade Na₂CO₃ como de costumbre.
3. Para el cultivo de Synechococcus, añadir 10 ml de 1 M 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanolsulfónico, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(2-ácido etanosulfónico) (HEPES) y 1 ml de vitamina B12 (Tabla 1) a 1 L de medio BG11.
   NOTA: La transformación de cepas cultivadas en medios BG11 disponibles comercialmente es significativamente menos eficiente que en las recetas de medios BG11 descritas aquí y, por tanto, no se recomienda.

2. Almacenamiento a largo plazo de cepas

1. Prepara un cultivo fresco de la cepa inoculando un lazo lleno de células en 30-50 ml de medio BG11. Cultiva el cultivo durante 3-4 días hasta que tenga un diámetro exterior_{de 750nm} = 0,4 a 0,7.
2. Lava las células una vez con BG11 y vuelve a suspender en ~2 ml de BG11.
3. Añade 0,8 ml de células concentradas a un solo tubo. Luego añade 0,2 ml de glicerol esterilizado al 80% con filtro.
4. Opcional: Añadir 0,93 ml de células concentradas a otro tubo. Añade 0,07 ml de DMSO a este tubo.
   CAUTELA: El DMSO es tóxico y debe tratarse con la protección adecuada.
5. Guarda ambos tubos a -80 °C. Para reactivar las cepas, retira el tubo y raspa algunas células con un palillo romo sobre una placa de agar sin antibióticos. Haz el sprint normal usando un anillo estéril.

Tabla 1: Soluciones utilizadas en este estudio

Recetas de solución para el fondo
Químico	Cantidad (g)
100x BG11 (por L)
NaNO 3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Ácido cítrico	0.6
Añade 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0
0,25 MNa 2EDTA, pH 8,0 (por 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Elementos traza (por 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4.2H 2O	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
Culata de hierro (por 100 ml)
Citrato de amonio férrico	1.11
Fondo de fosfato (por 100 ml)
K2HPO 4	3.05
Na2CO3 stock (por 100 ml)
Na2CO3	2
Tampón TES, pH 8,2 (por 100 ml)
TES	22.9
NaHCO 3 (por 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (por 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamina B12 (por 50 ml)
Cianocobalamina	0.02
Medios Luria Bertani (por 500 ml)
Caldo Luria Bertani	12.5
1 MMgCl 2 (por cada 100 ml)
MgCl 2,6H 2O	20.33
Solución A (por 200 ml)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morfolino)ácido etanosulfónico hidratado, 4-Ácido morfolineanosulfónico (MES)	0.4265
Solución A + glicerol
Solución A de 10 ml
1,5 ml de glicerol

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Ácido cítrico	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Pescador	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrato de amonio férrico	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pescador	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pescador	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cianocobalamina	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sacarosa	Pescador	SUC001
Placa de Petri de 90 mm con triple ventilación	Greiner	633185
Filtros de 0,2 μm	Sartorio	16534
100 ml de matrazas cónicas	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	Phusion	F-530
Agarosa	Melford	MB1200
Kit de purificación de ADN	MoBio	12100-300
Endonucleasas de restricción	NEB
Ligasa T4	Termo Científica	EL0011
Caldo Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Sulfato de kanamicina	Sigma	60615
Ampicilina	Sigma	A9518
Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET	Termo Científica	K0503
Tubo de fondo redondo de 14 ml	BD Falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasa	Promega	M7805
Cuentas de vidrio de 425-600 μm	Sigma	G8772
Glicerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Bombillas fluorescentes	Gro-Lux	69
Fotobiorreactor multitrón HT	Infors