Modelado de la fagocitosis mediada por complemento utilizando glóbulos rojos opsonizados in vitro

Resumen

Fuente: Nagre, N., et al. Fagocitosis de macrófagos alveolar y eliminación bacteriana en ratones. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demuestra la evaluación de la fagocitosis mediada por receptores del complemento utilizando glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM y complemento, seguida de su captación por macrófagos de ratón. El grado de fagocitosis se cuantifica midiendo un producto cromogénico azul formado por la oxidación catalizada por hemoglobina del diaminofluoreno.

Protocolo

1. Fagocitosis mediada por FcγR y CR

1. Para la opsonización, incubar 2 x^{10 glóbulos rojos de oveja} (SRBCs) con 50 μL de anti-SRBC-IgM de conejo o 50 μL de anti-SRBC-IgG de conejo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Incubar SRBCs con opsonización IgM con 50 μL de suero humano deficiente en C5 (C5D) durante 30 minutos a 37 °C para fijar los fragmentos de complemento C3b y C3bi sobre SRBCs recubiertos de IgM.
3. Siembra células macrófagas murinas (células MH-S) (10.000 células/pozo) en una placa de 96 pozos e incuba durante la noche para lograr una confluencia del ~70%. Añadir 100 μL de 1 x 10 SRBCs opsonizados de⁷/mL a cada pozo de células MH-S e incubar durante 1 hora a 37 °C. Lavar los SRBCs sin unión muy rápidamente (~1 min) con 100 μL de tampón de lisis cloruro de amonio-potasio (ACK).
4. Lisar las células con SDS al 0,1% y añadir 50 μL de 2,7-diaminofluoreno (DAF) que contiene un 3% de peróxido de hidrógeno y 6 de urea M. Mide la absorbancia de la formación de azul de flúor catalizada por hemoglobina a 620 nm.
5. Determina el número de SRBCs utilizando una curva estándar con valores de absorbancia de 620 nm con un número conocido de SRBCs. De manera similar, procesan células MH-S incubadas con SRBCs no opsonizados para usarlas como controles negativos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,7-diaminofluoreno (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Grado de Biología Molecular
70% etanol	Decon Labs Inc.	18C27 B	Grado analítico
Placa de 96 pozos	Corning	3603	Grado de Biología Celular
Búfer de lisis ACK	Tecnologías de la vida	A10492	Grado de Biología Molecular
Suero deficiente en C5	Sigma-Aldrich	C1163	Reactivo bioquímico
Centrifugadora	Labnet International	C0160-R
Citocentrifuga Cytospin 4	Thermofisher Scientific	A78300101 Número 11
Medios de cultivo celular DMEM	Gibco	11995-065	Grado de Biología Celular
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grado de Biología Celular
Citómetro de flujo	BD Biociencias	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinzas	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adecuado para la disección de animales de laboratorio
Plato de fondo de cristal	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Grado de Biología Celular
Jeringuilla de alta presión	Penn-Century	FMJ-250	Adecuado para uso en animales de laboratorio
Homogeneizador	Omni International	TH-01
Peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich	H1009	Grado analítico
Microscopio de fluorescencia invertida	Olimpo	IX73
MicroPulverizador Aerosolador	Penn-Century	IA-1C	Adecuado para uso en animales de laboratorio
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Grado reactivo
PBS	Gibco	20012-027	Grado de Biología Celular
conejo anti-SRBC-IgG	MP Biomedicina	55806	Adecuado para inmunoensayos
conejo anti-SRBC-IgM	Laboratorios Cedarline	CL9000-M	Adecuado para inmunoensayos
Tijeras	Miltex	5-2	Adecuado para la disección de animales de laboratorio
glóbulos rojos de oveja (SRBCs)	MP Biomedicina	55876	SRBCs lavados y preservados