Localización bacteriana e interacción del huésped en tejido pulmonar humano por imagen

Abstract

Fuente: Mills, B., et al., Cribado óptico de sondas bacterianas nuevas en tejido pulmonar humano ex vivo mediante endomicroscopía láser confocal. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra imágenes en tiempo real de Staphylococcus aureus marcado con fluorescencia en suspensión y tejido pulmonar utilizando microscopía de fluorescencia confocal fibrada.

Protocol

1. Recogida de datos con endomicroscopía láser confocal (CLE)
   1. Tras la configuración, se abrirá una ventana para seleccionar la ubicación de almacenamiento y el prefijo del archivo. Selecciona la carpeta deseada para el almacenamiento de datos y nombra el prefijo en consecuencia.
   2. Coloca los pedales para que el operador pueda acceder fácilmente a ellos. Pedal izquierdo: láser encendido/apagado; pedal central: pausa; Pedal derecho: Grabar/Detener.
      NOTA: Los controles láser también pueden accederse a través de controles en pantalla.
   3. Haz clic en 'iniciar' en pantalla o pulsa el pedal izquierdo para encender el láser. Esto iniciará la adquisición y obtendría imágenes usando el 100% de potencia láser y una tasa de 12 fotogramas/s (configuración predeterminada).
      NOTA: Para otras aplicaciones, estos ajustes pueden modificarse en pantalla si es necesario, dependiendo del tipo de muestra.
   4. Imagina cada una de las muestras de suspensión bacteriana.
      1. Inserta el extremo distal de la fibra de imagen FCFM (microscopía de fluorescencia confocal con fibras) y mueve la fibra lentamente a través de la suspensión para examinar la muestra.
      2. Graba vídeos de cualquier duración (hasta 10 minutos) pulsando el pedal derecho o seleccionando los controles de grabación en pantalla, mientras la fibra se mueve lentamente alrededor de la muestra.
      3. Limpia el extremo distal de la fibra de imagen FCFM con 8% de H_{, 2O2} y tejidos de limpieza de lentes entre muestras. ​
         NOTA: Duraciones típicas de vídeo de 10-30 s son suficientes para la imagen in vitro .
   5. Haz una imagen de cada muestra de tejido pulmonar.
      1. Inserta el extremo distal de la fibra de imagen FCFM en la muestra, asegurando el contacto directo entre el extremo de la fibra y el tejido. Mueve suavemente el extremo de la fibra de imagen para examinar la muestra.
         NOTA: Levantar el extremo de la fibra alejándolo del tejido se retirará del plano focal; sin embargo, esto puede utilizarse para obtener imágenes de bacterias marcadas que no están adheridas al tejido.
      2. Graba vídeos de cualquier duración (hasta 10 minutos) pulsando el pedal derecho o seleccionando los controles de grabación en pantalla, mientras la fibra se mueve lentamente alrededor de la muestra.
         NOTA: Normalmente, duraciones de vídeo de 30 s son suficientes para obtener imágenes ex vivo en tejido.
      3. Limpia el extremo distal de la fibra de imagen FCFM con tejidos limpiadores de lentes y 8% de_H2O₂ entre muestras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfugas	SciQuip	90616	Microcentrífuga de mesa pequeña
Placa de 96 pozos	Corning	3370	Placa de ensayo
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Tinte fluorescente comercial
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Dispositivo de endomicroscopía láser confocal
Cletop-S	Cletop	14110601	Limpiador de fibras
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	Tubo microfuge de 1,5 mL
Solución salina tamponada con fosfato de gibco	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - material de lavado
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Software de recogida y procesamiento de datos para el sistema de investigación CellVizio 488 nm
AlveoFlex de investigación no estándar 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibra de microscopía de fluorescencia confocal fibrada
Kit Quanti 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Kit de calibración para el sistema CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Cepa bacteriana utilizada en este estudio
Cuveta semi-micro de espectrofotometría	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Para espectrofotometría
Confort con termomezclador	Eppendorf	41102422	Calefactor de bancada con vibración