Limpieza selectiva de gusanos de Caenorhabditis para el enriquecimiento de la microbiota intestinal

Resumen

Fuente: Morgan, E., et al. Limpieza selectiva de nematodos silvestres Caenorhabditis para enriquecer bacterias del microbioma intestinal. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demuestra un protocolo para aislar bacterias intestinales de interés de gusanos silvestres de Caenorhabditis . Primero se muere de hambre y lava a los gusanos para eliminar bacterias residuales de su superficie e intestino, preservando al mismo tiempo los microbios objetivo. Tras la limpieza superficial y varios pasos de arrastre, los gusanos se diseccionan para extraer los intestinos que contienen las bacterias de interés, que luego se recogen y congelan para su almacenamiento.

Protocolo

1. Disección intestinal e identificación por PCR de especies microbianas

1. Criar animales a 20 °C durante 3-4 días para que se mueran de hambre y reducir la cantidad de bacterias OP50-1 (cepa Escherichia coli OP50-1). Añade 5 mL de medio M9 a la placa de gusanos hambrientos.

2. Utilizando una pipeta y bulbo de vidrio estériles, sube los gusanos M9+ desde la placa y transfiere a un tubo centrífugo estéril de 15 mL.

3. Utilizando una centrífuga clínica, centrifugar los gusanos del tubo a 1000 x g durante 30 s a temperatura ambiente.

4. Utilizando una pipeta estéril de 15 mL, retirar el sobrenadante del tubo de la centrífuga sin molestar los gusanos vivos en el fondo del tubo.

5. Añadir 10 mL de M9 + 0,05% Triton X-100 e incubar el tubo en un nutador durante 20 minutos para eliminar microbios externos. Repite cuatro veces para lavar las lombrices.

6. Tras el último lavado, utilizando una punta de pipeta estéril, se retira el sobrenadante sin alterar el pellet en el fondo en 100 μL de la solución.

7. Usando una punta de pipeta estéril, transfiere a M9 y los gusanos a una placa NGM sin sembrar y deja que la placa se seque mientras los gusanos se mueven durante 20 minutos para ayudar a eliminar el OP50-1 de la cutícula y el intestino.

8. Añadir 250 μL de M9 a la placa seca y utilizar una pipeta de cristal para transferir M9+ lombrices a una nueva placa NGM sin siembra. De nuevo, deja que el plato se seque y deja que las lombrices se arrastren durante 20 minutos.

9. Añadir 250 μL de M9 a la placa y transferir 100 μL de los gusanos M9+ a un cristal de reloj limpio.

10. Usando dos agujas estériles de jeringuilla de 26 G, decapitar los nematodos sujetando el gusano con una aguja y usando la otra para cortar el gusano. Tras la decapitación, el intestino (granular) y la gónada (transparente) del cuerpo salen naturalmente del cuerpo.

11. Corta un trozo del intestino expuesto sujetándolo con una aguja y cortándolo con la otra.

NOTA: Si es posible, verifica que el microbio de interés sigue presente en intestinos evertidos mediante microscopía Normarski, hibridación fluorescente in situ (FISH) o inmunohistoquímica.

12. Transfiere un intestino disecado a un tubo PCR de 0,5 mL que contenga 10 μL de agua estéril. Repite para un total de al menos 5 tubos PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que contienen intestinos de diferentes animales.

13. Congela los tubos de PCR a -80 °C durante un mínimo de 5 minutos. Saca los tubos de PCR del congelador y descongela las muestras.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
10% SDS	Invitrogen	AM9822
Aguja BD PrecisionGlide - 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Estreptomicina	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tetraciclina	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Gafas de reloj	VWR	470144-850