Hibridación fluorescente in situ de bacterias intestinales en secciones intestinales de ratón

Resumen

Fuente: Ng, K. M., Tropini, C. Visualización de las interacciones microbiota-huésped intestinal mediante hibridación in situ por fluorescencia, tinción de lectinas e imagen. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demuestra el procedimiento de hibridación fluorescente in situ (FISH) para teñir la microbiota intestinal dentro del tejido intestinal del ratón mediante la hibridación de sondas fluorescentes con ARNr bacteriano (ácido ribonucleico ribosómico) y la contracoloración de las estructuras del huésped para su análisis microscópico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente

1. Tinción bacteriana con FISH (hibridación fluorescente in situ)
   1. Utiliza un bloqueador de líquidos o un bolígrafo PAP (pluma barrera hidrofóbica) para limitar el área de expansión líquida rodeando el área de cada sección de tejido. Asegúrate de que la tinta no entre en contacto con la sección en sí. Crea un círculo lo más cerca posible de cada sección de tejido sin contactar con el tejido para minimizar la superficie que debe cubrir la solución de hibridación.
   2. Prepara la solución de hibridación: por cada 50 μL de solución de hibridación precalentada, añadir 0,5 μg de sonda (por ejemplo, 0,5 μL de sonda de 1 μg/μL). Pipetear la solución de hibridación sobre las secciones del lavabos (~20 μL/sección, dependiendo del tamaño de la sección o círculo). Protege la solución de hibridación y los portaobjetos de la luz a partir de este punto durante los pasos de incubación y almacenamiento.
   3. Asegúrate de que el volumen de líquido utilizado cubra toda la sección al cubrirlo con una cubierta de plástico flexible. Incuba el portaobjetos en una cámara húmeda para reducir la evaporación. Crea una cámara húmeda con una caja de punta de pipeta con toallitas o papel en el fondo que hayan sido empapados con exceso de solución de hibridación o solución salina con fosfato (PBS) para proporcionar humedad. Incubar las secciones a 45-50 °C, dependiendo del conjunto de sondas, durante >3 horas.
   4. Calienta el buffer de lavado de FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl a 50 °C durante el periodo de incubación. Prepara suficiente tampón de lavado para cubrir las láminas del tarro de Coplin.
   5. Quita las cubiertas de plástico; incuba las láminas en el buffer de lavado de FISH en un tarro de Coplin, ambos precalentados a 50°C. Vuelve a colocar el tarro de Coplin en el horno a 50°C durante 10-20 minutos. Para muestras gruesas, quita las cubiertas del tarro Coplin añadiendo el buffer y descolocando suavemente las cubiertas para evitar manchar la loncha.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tarro de coplin	Fisher	08-813E
Tapa de cristal, 22 × 22 mm, nº #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Resuspendido a 5 mg/mL
Caja(s) vacía(s) de la punta de la pipeta			Para fundir parafina
Sondas FISH
Solución de hibridación FISH	--	--	20 mM de pH 7,4 de Tris–HCl, 0,9 M de NaCl, 0,01% (p/v) de SDS en agua libre de nucleasa. Adición opcional de formamida del 5–50% (v/v)
Amortiguador de lavado de peces	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Lectina Ulex Europaeus Agglutininina (UEA-1) marcada con fluorescencia	Laboratorios Vector	FL-1061 (marcado con fluoresceína) o RL-1062-2 (marcado con rodamina)	UEA-1 marca glicanos fucosilados, por lo que no es apropiado para ratones libres de gérmenes ni para muestras de hospedadores deficientes en fucosiltransferasa 2 (FUT2).
Pinzas
Cubiertas flexibles de plástico HybriSlip, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	para los pasos de hibridación FISH, se pueden sustituir por cubiertas de vidrio
Pluma PAP de barrera hidrofóbica ImmEdge	Laboratorios Vector	H-4000
Kimwipes
Contenedores multipropósito para almacenamiento de especímenes, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Puedes sustituirlo por un recipiente de cristal o polietileno de tu elección. El metacarno no es compatible con el poliestireno ni el metal.
Esmalte de uñas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72180	Cualquier esmalte de uñas debería servir
Horno			Rango necesario: 45-60 °C
PBS, solución salina tamponada con fosfato (solución 10x)	Fisher	BP3991	Diluir a 1x para el protocolo
Cloruro de sodio	Fisher	S271
Solución de cloruro de Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Agua, libre de nucleasas	Fisher	BP2484100