Aislamiento basado en ultracentrifugación de vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila

Resumen

Fuente: Jung, A. L., et al. Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra el aislamiento de vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila mediante centrifugación secuencial, filtración estéril y ultracentrifugación. Los OMVs purificados, enriquecidos en proteínas de membrana y lipopolisacáridos, son adecuados para estudios de interacción huésped-patógeno.

Protocolo

1. Cultivar Legionella pneumophila

1. Esparce la cepa de L. pneumophila Corby (tipo salvaje, WT) sobre placas de agar de extracto de levadura de carbón (BCYE) tamponado e incubala a 37 °C durante 3 días. Inocular 10 mL de caldo de extracto de levadura (YEB) a un OD₆₀₀ de 0,3 con L. pneumophila de la placa de precultivo; incubar la bacteria a 37 °C en un agitador giratorio (150 rpm) durante 6 horas.
2. Verifica la pureza del cultivo líquido extendiendo 100 μL de la suspensión sobre una placa de ágar sanguíneo. Incubar durante la noche a 37 °C.
3. Añadir el cultivo líquido restante a 90 mL de medio YEB fresc....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	82.1473
Rotor de 70 Ti	Beckman Coulter Incorporación (California, EE. UU.)	337922
Cuvettes	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	67.742
Incubadora Heracell 240i CO₂	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	75004515
Bucle de inoculación	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlín, Alemania)	L 1825
Agitador giratorio (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)	80-2116-30
Filtro estéril (tamaño de poros: 0,22 μm)	Corning Incorporated (Nueva York, EE. UU.)	431096
Carbón activado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5210.2
Agar Columbia con 5% de sangre de oveja	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)	254005
Extracto de levadura	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	2363.2