Aislamiento basado en ultracentrifugación de vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila

Resumen

Fuente: Jung, A. L., et al. Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demuestra el aislamiento de vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila mediante centrifugación secuencial, filtración estéril y ultracentrifugación. Los OMVs purificados, enriquecidos en proteínas de membrana y lipopolisacáridos, son adecuados para estudios de interacción huésped-patógeno.

Protocolo

1. Cultivar Legionella pneumophila

1. Esparce la cepa de L. pneumophila Corby (tipo salvaje, WT) sobre placas de agar de extracto de levadura de carbón (BCYE) tamponado e incubala a 37 °C durante 3 días. Inocular 10 mL de caldo de extracto de levadura (YEB) a un OD₆₀₀ de 0,3 con L. pneumophila de la placa de precultivo; incubar la bacteria a 37 °C en un agitador giratorio (150 rpm) durante 6 horas.
2. Verifica la pureza del cultivo líquido extendiendo 100 μL de la suspensión sobre una placa de ágar sanguíneo. Incubar durante la noche a 37 °C.
3. Añadir el cultivo líquido restante a 90 mL de medio YEB fresco e incubar en un agitador giratorio (37 °C y 150 rpm) para alcanzar un OD₆₀₀ de 3,0-3,5, lo que tarda aproximadamente 16-20 horas.

2. Preparar y cuantificar Las vesículas de membrana externa de L. pneumophila (OMVs)

NOTA: Realizar todos los siguientes pasos de centrifugación en condiciones estériles y a 4 °C.

1. Centrifuga el cultivo líquido a 4.000 x g durante 20 minutos para pelletar las bacterias. Transfiere el sobrenadante a tubos de centrifugación nuevos, descarta el pellet bacteriano y repite la centrifugación (4.000 x g durante 20 minutos). Repite este paso una vez.
2. Filtrar el sobrenadante restante dos veces (tamaño de poro: 0,22 μm). Transfiere el sobrenadante libre de bacterias a tubos de ultracentrífuga y ultracentrífuga a 100.000 x g durante 3 horas.
3. Descarta el sobrenadante. Resuspende el pellet OMV en solución fisiológica estéril amortiguada con fosfato (PBS) y ultracentrífuga (100.000 x g durante 3 horas) para eliminar proteínas contaminantes y LPS.
4. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el balótulo OMV en 500 μL de PBS estéril. Haz una estilla de 20 μL en una placa de agar en sangre y en una placa de agar BCYE para excluir la contaminación bacteriana de las vesículas preparadas. Incuba la placa de agar en sangre durante la noche y la placa BCYE durante 3 días (ambas a 37 °C).
   NOTA: La concentración de 100 mL de cultivo de L. pneumophila suele ser de 1 μg/μL. Almacenar los OMVs preparados y cuantificados a -20 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	82.1473
Rotor de 70 Ti	Beckman Coulter Incorporación (California, EE. UU.)	337922
Cuvettes	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	67.742
Incubadora Heracell 240i CO₂	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	75004515
Bucle de inoculación	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlín, Alemania)	L 1825
Agitador giratorio (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Alemania BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)	80-2116-30
Filtro estéril (tamaño de poros: 0,22 μm)	Corning Incorporated (Nueva York, EE. UU.)	431096
Carbón activado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5210.2
Agar Columbia con 5% de sangre de oveja	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)	254005
Extracto de levadura	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	2363.2