Aislamiento y cultivo de Caenorhabditis elegans - Bacterias asociadas

Resumen

Fuente: Petersen, C. et al., Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demuestra el aislamiento y cultivo de especies bacterianas asociadas a Caenorhabditis elegans. Una lisis basada en perlas de C. elegans, seguida de un cultivo selectivo, permite aislar diversas cepas microbianas para su análisis posterior.

Protocolo

1. Aislamiento y cultivo de bacterias asociadas a nematodos (Figura 1)

1. Para aislar bacterias, preparar una placa de 96 pozos con tres perlas estériles de 1 mm, 20 μL de tampón de sales medias mínimas M9 (M9) por pozo, y pipete un nematodo individual lavado a cada pozo, transfiriendo la menor cantidad posible de líquido.
   NOTA: Alternativamente, las poblaciones de gusanos pueden lavarse de las placas con un tampón M9, y ~300 μL de tampón M9 que contiene gusano pueden transferirse a tubos de 2 mL con 10-15 perlas.
2. Descompone los nematodos usando un homogeneizador de perlas (por ejemplo, batiendo las perlas durante 3 minutos a 30 Hz). Centrifuga brevemente la placa o tubos para que el líquido llegue al fondo (por ejemplo, durante 10 s a 8000 x g a temperatura ambiente, RT).
   NOTA: El uso de este método llevó al aislamiento de taxones bacterianos similares a los revelados por la secuenciación de amplicones del ADN ribosómico 16S (ADNr), lo que sugiere que el batido de cuentas descrito deja intactas la mayoría de las células bacterianas.
3. Recoge el sobrenadante, diluyéndolo en serie a 1:10 y placando hasta 100 μL sobre placas de agar de 9 cm.
   1. Para asegurar que la mayoría de las bacterias puedan cultivarse, utiliza una variedad de medios alternativos con diferentes composiciones de nutrientes, incluyendo agar de soja tripticasa diluido (TSA, dilución 1:10), agar MacConkey, agar glucosa Sabouraud, agar dextrosa patata o agar peptona dextrosa de levadura.
4. Incubar las placas a las condiciones de temperatura media del lugar de muestreo (por ejemplo, temperaturas entre 15-20 °C en zonas templadas) durante 24-48 horas.
5. Utiliza la técnica estándar de tres estrías y un lazo estéril para obtener cultivos bacterianos puros (Figura 1).
   1. Toma una sola colonia de una placa usando un lazo estéril o un palillo y estirala sobre una nueva placa de agar que contenga el mismo medio de agar que se usa para la purificación. Asegúrate de usar solo aproximadamente un tercio de la placa.
   2. O bien usa un lazo estéril nuevo o esteriliza un lazo reutilizable y pásalo por la primera franja para crear una segunda línea en otro tercio de la misma placa.
   3. Repite este paso arrastrando un lazo estéril por la segunda franja.
   4. Incuba la placa bajo las mismas condiciones de crecimiento que se usan para el aislamiento. Esta técnica debe dar lugar a que crezcan colonias individuales en el área de la tercera raya.
      NOTA: Puede ser necesario repetir el paso de purificación varias veces, ya que los aislados naturales tienden a formar biopelículas y/o agregados.
6. Cultivar las colonias puras en un medio líquido (del mismo tipo que el medio de agar) usando la misma temperatura y tiempo de crecimiento que antes (paso 1.4)

Resultados

Figura 1: Identificación de especies y aislamiento de bacterias individuales. Los nematodos individuales se descomponen mediante un homogeneizador de perlas, y el ADN se aísla para determinar la especie mediante PCR o secuenciación. Alternativame...