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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Aislamiento de la Comunidad Bacteriana Intracelular (CCI): Pipetificación bucal de los CCI
NOTA: Todos los métodos descritos en esta sección han sido sometidos a una evaluación institucional de riesgos. El pipeteo bucal conlleva el riesgo inherente de ingestión de la solución que se está transfiriendo. Este riesgo se mitiga en gran medida gracias a los volúmenes de nanolitros que utiliza este protocolo, y recomendamos que todos los usuarios del protocolo presten atención a las notas de precaución y práctica que se enumeran aquí y en la discusión.
- Después de que las células hayan sido raspadas en el PBS (solución salina tamponada con fosfato), se instala el aparato de micropipeteo bucal (Figura 1C).
- Inserta el extremo más grueso del capilar de vidrio tirado (el extremo sin tirar) en el tapón de goma (extremo blanco) del tubo aspirador.
- Inserta el extremo estrecho de la punta de una pipeta de 1 mL en el otro extremo abierto (rojo) del tubo aspirador, asegurando un ajuste ajustado.
- Inserta el extremo estrecho de una pipeta aspiradora de 2 mL en el extremo abierto y ancho de la punta de la pipeta de 1 mL, asegurando de nuevo un ajuste ajustado.
NOTA: El sistema resultante permite al investigador pipetear por boca desde el extremo más ancho y abierto de la pipeta aspiradora para crear una suave fuerza de succión desde el extremo estrecho del tubo capilar en el otro extremo del aparato. - Prueba el último aparato de micropipeteo bucal utilizando una placa de Petri de 100 mm que contiene agua desionizada fresca. Una ligera acción de succión en el extremo abierto de la pipeta aspiradora (similar a beber con una pajita) debería aumentar el nivel de líquido en el capilar, pero no hacer que el agua desionizada se desborde hacia el tubo aspirador. Usa una mano para controlar el tubo capilar, mientras que con la otra ajusta la posición de la placa de Petri.
NOTA: La fuerza de succión necesaria para pipetear por boca un solo IBC variará entre los investigadores. Sin embargo, se recomienda que cada investigador que intente esta técnica comience con una succión débil y la aumente poco a poco si no sube líquido por el capilar. No hay necesidad de una fuerza mayor que chupar una pajita para beber. Si el capilar no parece captar líquido durante la prueba del paso 1.1.4, es posible que el capilar o el tubo aspirador estén ocluidos y necesiten ser reemplazados. Además, se recomienda que todos los nuevos investigadores practiquen primero el control de la succión en el aparato de pipeteo bucal utilizando agua esterilizada. Además, hay que tener en cuenta que el control del volumen que ocupa el aparato de pipeteo bucal se realiza mediante el uso de la lengua del investigador. La lengua puede ajustar finamente la intensidad de la succión aplicada, además de actuar como parada de emergencia. - Tras lograr una captación exitosa del líquido, prueba la capacidad de expulsarlo del capilar soplando suavemente en el extremo abierto de la pipeta aspiradora. Asegúrese de que no se formen burbujas durante el proceso de expulsión del líquido para evitar la contaminación de los IBC durante el paso 1.5.
NOTA: Al igual que con la succión, la intensidad de la presión positiva aplicada por el investigador para expulsar el IBC dentro del tubo de la centrífuga variará entre los investigadores. Se recomienda que los investigadores nuevos en este protocolo practiquen el paso 1.1 unos días antes de la infección real. Una sugerencia para practicar la micropipeteación bucal es practicar la transferencia de pequeños volúmenes de agua esterilizada mezclada con unas gotas de tinte alimentario (para visibilidad) utilizando el aparato de micropipeta bucal.
- Coloque la suspensión de células raspadas bajo el microscopio de disección e identifique los IBC como grandes agregados fluorescentes (Figuras 1A, B). El rango ideal de aumento es de 20-40x. Sumerge el extremo fino del capilar de vidrio en un tubo fresco de PBS durante 1 segundo para reducir la absorción de volumen no deseado mediante la acción capilar.
- Mirando por el microscopio, identifica el IBC de interés y acerca lentamente el extremo abierto del tubo capilar hacia el IBC. Utiliza el extremo fino del capilar de vidrio para barrer células adicionales cerca de cada IBC y evitar la aspiración de dos o más células, o para romper agregados más grandes de células.
- Mientras miras por el microscopio, aplica una fuerza de succión muy pequeña en el extremo opuesto (pipeta aspiradora) del aparato de micropipeteo bucal para guiar el IBC hacia el capilar de vidrio.
- Después de recoger el IBC, mueve el capilar a un tubo centrífugo vacío de 1,5 mL y aplica una ligera presión positiva para expulsar la gota y el IBC al tubo de la centrífuga (Figura 1D).
- Repite los pasos 1.3-1.6 en tantos IBC como sea necesario desde la vejiga actual, antes de pasar a la siguiente vejiga. Cambia con frecuencia las pipetas y capilares aspirados para evitar la acumulación de saliva.
PRECAUCIÓN: Cuando se trabaja con cepas infecciosas (o clínicas) de bacterias, hay que monitorizar constantemente el nivel de solución en el capilar. No dejes que el nivel de líquido que se está pipeteando desborde desde el borde del capilar hacia el tubo aspirador. Si esto ocurre, cambia inmediatamente a otro tubo aspirador y descarta la configuración anterior. - Repita los pasos 1.2-1.6 en todas las vejigas extraídas, o hasta que se haya recogido un número suficiente de muestras biológicas para el grupo experimental.
- (Opcional) Repite los pasos 1.6 y 1.7 hasta que todos los grupos experimentales (o ratones) hayan sido eutanasiados y se hayan recogido suficientes muestras biológicas de cada grupo.
