Detección de la expresión del gen objetivo en un cerebro de ratón infectado por bacterias

Resumen

Fuente: Zhang, S., et al. Vía subaracnoide intracraneal de la infección para investigar los roles de los biofilms de Streptococcus suis en meningitis en un modelo de infección murina. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demuestra la detección de la expresión génica objetivo en el cerebro de un ratón infectado por bacterias. Se extrae ARN, se trata con una enzima que degrada el ADN y se transcribe inversamente en ADNc. El ADNc se amplifica mediante ciclos térmicos con cebadores específicos de cada gen, mientras que un tinte que se une al ADN amplificado, emitiendo fluorescencia. Las señales de fluorescencia se analizan para confirmar la presencia del gen objetivo.

Protocolo

1. Preparación de bacterias

Nota: La cepa virulenta P1/7 de Streptococcus suis (S. suis) serotipo 2 fue aislada de un cerdo enfermo con meningitis. La cepa P1/7 se cultivó en caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro de THB: Heart Infusion, 3,1 g; neopeptona, 20,0 g; dextrosa, 2,0 g; cloruro de sodio, 2,0 g; fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g) y se emplató sobre agar Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Heart Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrosa, 2,0 g; cloruro de sodio, 2,0 g; fosfato disódico, 0,4 g; carbonato sódico, 2,5 g; agar, 15,0 g) a 37 °C y 5% de_CO2.

1. Colección de células planctónicas de la cepa P1/7
   1. Recoger 5 mL de células planctónicas de cultivos en fase media logarítnica (_{DO 600}=0,6), centrifugar durante 3 minutos a 8000 × g y luego lavar 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Resuspende las células con 5 mL de glicerol al 25% en THB, alicuota en 5 tubos y luego almacena a -80 °C.
2. Colección de células de estado de biofilm de la cepa P1/7
   1. Toma 20 mL de un cultivo nocturno y añade 180 mL de THB fresco; dividir el cultivo diluido por igual en 10 placas redondas de cultivo y luego colocar las placas en una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2 durante 24 horas.
   2. Tras la incubación, agita suavemente la placa para volver a suspender las bacterias que no se han adherido a la placa y luego descarta el sobrenadante por aspiración.
      NOTA: Sacude la placa suavemente y evita volver a suspender el sedimento.
   3. Añadir 5 mL de PBS para extraer las células de estado de biofilm, resuspender completamente el sedimento y luego transferir la muestra a un nuevo tubo.
   4. Sonica las células de estado de biofilm desde el último paso con los siguientes parámetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s encendidos y 10 s apagados.
   5. Centrifugar durante 3 minutos a 8000 × g y almacenar el sobrenadante a -80 °C.
      NOTA: El sobrenadante puede contener componentes de biofilm y puede utilizarse para resuspender las bacterias del biofilm antes de la infección, como se describe en los experimentos con animales (Paso 2).
   6. Resuspende el sedimento con 10 mL de glicerol al 25% en THB y luego almacena las células del estado de biofilm a -80 °C.

2. Experimentos con animales

1. Utiliza SPF a ratones BALB/c hembras de 6 semanas en este estudio. Infectar a todos los ratones por la vía intracraneal subaracnoidal de la infección, cuyo lugar de inyección se encuentra a 3,5 mm rostral del bregma.
   1. Para análisis histopatológico, infectar dos grupos de ratones (5 ratones por grupo) utilizando células planctónicas o células del estado de biofilm a una dosis de 3 × 10⁷ unidades formadoras de colonias (UFC), y otros 5 ratones fueron inyectados con PBS como control.
   2. Para la detección de la expresión de ARNm de TLR2 y citocinas en el cerebro, infectar dos grupos adicionales de ratones (6 ratones por grupo) utilizando células planctónicas o células del estado de biofilm a una dosis de 3 × 10⁷ UFC.
   3. Determina el número de bacterias viables aplicando diluciones en serie sobre el THA.
   4. Eutanasiar a todos los ratones a las 12 horas de la infección para más investigación. ​
      NOTA: El glicerol del medio original debe eliminarse antes de la infección. Tanto las células planctónicas como las células del estado de biofilm recuperadas de -80 °C se lavan 3 veces con PBS. Luego, las células planctónicas se resuspenden con PBS y se diluyen a la dosis adecuada para la infección; Las células del estado de biofilm se resuspenden con el sobrenadante almacenado (del paso 1.2.5) y se diluyen a la dosis adecuada para la infección. El volumen de infección no debe superar los 50 μL.
2. Detección de la expresión de ARNm de TLR2 y citocinas en tejido cerebral
   1. Extrae el ARN total del tejido cerebral utilizando un kit de extracción de ARN.
      1. Para cada ratón, utiliza todo el tejido cerebral para extraer ARN. Divide todo el tejido cerebral en 5 tubos. Toma hasta 100 mg de tejido cerebral y añade 1 mL de solución para lisis a cada tubo que contiene la matriz lisadora proporcionada por el kit.
      2. Procesa el tubo en un homogeneizador durante 40 s a un ajuste de 6,0, y luego centrifuga el tubo a 12000 × g y 4 °C durante 5 minutos.
      3. Tras la centrifugación, transfiere la fase superior a un nuevo tubo microcentrífuga.
      4. Incubar la muestra transferida durante 5 minutos a temperatura ambiente; Añade 300 μL de cloroformo, vórtice durante 10 segundos y luego incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      5. Centrifuga el tubo a 12000 × g y 4 °C durante 5 minutos. Transfiere la fase superior a un tubo nuevo.
      6. Añade 500 μL de etanol absoluto frío al tubo antes de invertirlo 5 veces, y luego guarda la muestra a -20 °C durante al menos 1 hora.
      7. Centrifuga el tubo a 12000 × g y 4 °C durante 15 minutos y retira el sobrenadante. Lava el pellet con 500 μL de etanol frío al 75% en agua libre de RNasa (_H2O).
      8. Retirar el etanol, secar al aire el pellet durante 5 minutos a temperatura ambiente y volver a suspender el ARN en 100 μL de H₂O libre de RNasa.
      9. Incubar el ARN durante 5 minutos a temperatura ambiente y determinar la concentración de ARN usando un bioanalizador de ARN.
   2. Realizar síntesis de ADN complementario (cDNA), incluyendo la eliminación de ADN genómico (gDNA), utilizando un termociclador con un kit de reactivos de transcripción inversa (RT).
      1. Añadir 1 μg de ARN a un tubo que contenga 2 μL de 5x tampón de eliminación de ADNG, 1 μL de enzima de eliminación de ADNG y_H2Olibre de RNasa hasta que el volumen alcance los 10 μL. Incubar durante 2 minutos a 42 °C.
      2. Añade 10 μL de mezcla maestra (1 μL de enzima RT Mix I, 1 μL de mezcla de cebador RT, 4 μL de 5x Buffer 2 y 4 μL de H₂libre de RNasa) a la solución de reacción del último paso y luego mezcla suavemente. Procede inmediatamente con la reacción RT: 37 °C durante 15 minutos y luego 85 °C durante 5 segundos.
      3. Realizar el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando una máquina de PCR en tiempo real con un kit SYBR RT-qPCR. Añadir 10 μL de 2x enzima, 0,8 μL de cebador directo, 0,8 μL de cebador inverso, 0,4 μL de 50x ROX Reference Dye II, 2 μL de plantilla de cDNA y H_2Olibre de RNasa hasta alcanzar un volumen total de 20 μL.
      4. Procesar cada muestra en triplicado usando los siguientes parámetros térmicos: 30 s a 94 °C, seguido de 40 ciclos de 5 s a 95 °C y 34 s a 60 °C, con una etapa final de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C y 15 s a 95 °C. Los cebadores para RT-qPCR se enumeran en la Tabla 1. Se usaron los genes de mantenimiento B2m y 18s rRNA como controles internos.
   3. Calcula el cambio relativo de pliegue basándose en el método ^2-ΔΔCt .

Tabla 1: Cebadores para RT-qPCR.

Nombre Introductorio	Secuencia (5'-3')	Símbolo génico
IL-6 hacia adelante	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
Reversa IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 hacia adelante	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
Reversa TLR2	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Delantero CCL2	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 reverso	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
Delantera TNF-α	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
Reversa TNF-α	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m hacia adelante	GGTCTTTCTGTGTGCTTGTCT	B2M
β2m reversa	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2M
Delantero de 18	GTAACCCGTTGAACCCCATT	ARNr de 18
18s reverso	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	ARNr de 18

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo Todd Hewitt (THB)	Becton, Dickinson y Compañía	DF0492078	Disuelve 30 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Autoclave a 121° durante 15 minutos.
Agar	DSBIO	16C0050	Disuelve 15 g del polvo en 1 L de THB. Autoclave a 121° durante 15 minutos.
Sistema de Purificación de Agua de Referencia Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Sin Dnase/Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glicerol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Diluido con el mismo volumen de agua purificada, autoclave a 121° durante 15 minutos
4% de paraformaldehído	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25% de glutaraldehído	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	Diez veces diluido con agua purificada para fijar.
Etanol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Cloroformo	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Esceptrofotómetro	DeNovix Inc.	DS-11+
Trituradora de células de ultrasonido	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Centrifugadora	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Frigorífico	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Green Kit	MP Biomedicina	#6045-050
Instrumento FastPrep-24	MP Biomedicina	116005500
Instrumento para PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
Kit de reactivos PrimeScript RT con goma de goma gDNA	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A