Administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis para infección pulmonar en un modelo murino

Resumen

Fuente: Mueller, A., et al. Un modelo experimental para estudiar la coinfección tuberculosis-malaria tras la transmisión natural de Mycobacterium tuberculosis y Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo muestra la administración en aerosoles de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a ratones utilizando un sistema de cámaras basado en nebulizador para inducir infecciones pulmonares, proporcionando un modelo controlado y reproducible para estudiar la transmisión aérea de la tuberculosis y las interacciones huésped-patógeno in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Infección por aerosoles de ratones con MTB usando una cámara de aerosoles de Glas-Col

La mejor manera de estandarizar la infección por aerosoles en animales de experimentación con Mtb (Mycobacterium tuberculosis) es utilizar micobacterias de stocks congelados con títulos conocidos de CFU (unidades formadoras de colonias). Para preparar los cultivos de stock, se cultiva MTB en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con medio de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, Catalasa) y 0,05% Tween 80, una fuente de carbono para micobacterias, y se toman medidas para evitar la agrupación bacteriana al mismo tiempo. Los cultivos deben tener una densidad óptica (OD) ≤ 1 en el momento de la cosecha. Con una sobredosis más alta, aumenta la agrupación bacteriana y disminuye la viabilidad. Almacenar 1 ml de alicuotas a -80 °C. Determinar el número de UFC viables en stocks congelados emplatando una serie de diluciones de 10 veces de tres viales independientes en placas de agar 7H11 suplementadas con 0,5% de glicerol, 1 g/L de asparagina y OADC y enumerando las colonias tras 4 semanas de incubación a 37 °C. Realizar la infección por aerosoles como se describe a continuación.

1. Descongela los stocks de MTB con título conocido de CFU y mezcla cuidadosamente la suspensión cinco veces para dispersar los grumos bacterianos usando una jeringuilla de 1 ml equipada con una aguja de 27 G. Evita la producción de aerosoles.
2. Dependiendo de la dosis de infección deseada, transfiera el volumen requerido del material micobacteriano a un tubo de 50 ml que contiene solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS). El volumen final es de 6 ml.

NOTA: Al variar el número de microorganismos en esta suspensión, se varía la proporción de bacterias que portan gotas en aerosoles. Normalmente buscamos captar 100 bacilos viables por pulmón (infección en dosis bajas). En nuestra experiencia, esto requiere alrededor de 1-2 × 10⁶ Mtb/ml en un volumen total de 6 ml, de los cuales 5,5 ml están nebulizados. Se recomienda realizar una serie de pruebas experimentales con aerosoles con diferentes concentraciones de bacterias para encontrar las condiciones ideales para tu infección. Mientras que las infecciones de alta dosis con hasta 5.000 micobacterias pueden realizarse para acelerar el proceso infeccioso, tan solo 5 bacterias pueden usarse para infectar con éxito ratones mediante aerosol. La tasa de infección suele ser del 100%.

3. Retirar suficiente volumen (preparado por encima del volumen final requerido) para el blindaje y así determinar el título del inoculo; Normalmente retiramos 500 μl para cubrir triplicados técnicos.
4. Coloca a los animales en una cesta de malla compartimentada (un ratón por cesta) dentro de la cámara circular de aerosoles y cierra la tapa de la cámara de aerosol.

NOTA: Otros modelos están equipados con una cesta en forma de tarta compuesta por cinco compartimentos individuales, cada uno con capacidad para 20 ratones.

5. Fije la unidad nebulizadora Venturi a las tres juntas de vaso de acero inoxidable.
6. Retira la suspensión micobacteriana del tubo de 50 ml con una jeringuilla de 10 ml equipada con una aguja roma de 18 g y lleva la jeringuilla a la cámara del aerosol en una caja de transporte cerrada.
7. Retira la tapa de rosca de la unidad de nebulización e inyecta cuidadosamente la suspensión de micobacterias en el nebulizador. Evita la generación de aerosoles. Descarta la jeringuilla en un recipiente para objetos punzantes que contenga un 2% de Buraton. Sella el nebulizador con la tapa de rosca.
8. Enciende el interruptor principal y la lámpara UV. La pantalla del teclado de control muestra "Glas-Col Apparatus Co".
9. Enciende el interruptor del programa. La pantalla mostrará "¿Está listo el nebulizador?" "¿Está cargado el cesto?" Pulsa enter cuando esté listo". Pulsa enter.
10. La pantalla muestra "Enter Preheat Time 900"; Esto significa que el tiempo de precalentamiento del incinerador (que descontamina el aire de escape) es de 900 segundos. Pulsa Enter.
11. La pantalla mostrará "Introduzca el tiempo de nebulización 1.800"; Esto significa que el tiempo de nebulización está configurado por defecto en 1.800 segundos. Para alargar el tiempo de nebulización, introduce "2.400" y pulsa enter.

NOTA: Durante el ciclo de nebulización, el aire bajo presión atomiza la suspensión, generando así pequeñas gotas de aerosol que contienen micobacterias. Con el flujo principal de aire, estas gotas (de aproximadamente 2-5 μm de tamaño) se llevan hacia la cámara de aerosol.

 

12. La pantalla mostrará "Enter C.D. Time 1.800"; Esto significa que el ciclo de decaimiento tarda 1.800 segundos. Ponlo en "2.400" y pulsa Enter.

NOTA: Durante este ciclo, la nube que se ha acumulado en la cámara de aerosoles durante el ciclo de nebulización puede decaer. Las pequeñas gotas son inhaladas por los animales experimentales.

13. La pantalla mostrará "Enter Dec Time 900"; esto significa que el ciclo de descontaminación con luz UV durará 900 segundos. Pulsa enter. La máquina empezará a pasar por el precalentamiento, nebulización, desintegración de nubes y descontaminación por UV.
    PRECAUCIÓN: El caudalímetro de vacío debe indicar 60 pies cúbicos/hora (comprueba cuándo empieza el ciclo de precalentamiento; ajusta la válvula de control de vacío si es necesario) y el caudalímetro de aire comprimido 10 pies cúbicos/hora (comprueba cuándo empieza el ciclo de nebulización; ajusta la válvula de control de aire en consecuencia).
14. Cuando el ciclo termina, el teclado mostrará "Proceso Completado – Eliminar muestra". Apaga el programa, la luz UV y el interruptor principal de encendido.
15. Comprueba si la suspensión micobacteriana ha sido completamente nebulizada y, si no, registra el volumen restante retirando cuidadosamente la suspensión con una jeringuilla adecuada equipada con una aguja roma de 18 G. El volumen restante no debe superar 1 ml.
16. Retira el nebulizador de las juntas y colócalo en una bandeja con buratón al 2% durante un mínimo de 2 horas; normalmente la desinfección se realiza en O/N. Después, traslada el nebulizador a una bandeja nueva y enjuaga bien con agua. Deja que el nebulizador se seque al aire.
17. Abre la cámara de aerosoles y vuelve a poner a los animales en sus jaulas. Mete las cestas en bolsas de autoclave y autoclave. Limpia las superficies del interior de la cámara de aerosoles con Buraton al 2%.

NOTA: Por razones de seguridad, se debe llevar un respirador purificador de aire motorizado durante este procedimiento.

18. Utilizando los 500 μl restantes de la suspensión micobacteriana (véase el paso 1.3), se diluyen 10 veces de un triplicado técnico (3 x 100 μl) sobre placas de agar 7H11.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Buraton	Schülke		Ingredientes activos: aldehídos (formaldehído, glutaraldehído, oxalaldehído, etil hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Para cultivos de caldo de montaña
Middlebrook 7H11	BD Biociencias	283810	Medio de agar para el cultivo de MTB
Medio de enriquecimiento OADC Middlebrook	BD Biociencias	212240	Añade a 7H9 y 7H11 para la cultura de Mtb
Sistema de exposición a la inhalación	Glas-Col
Nebulizador-Venturi	Glas-Col