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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
1. Inoculación con Pseudomonas aeruginosa
- Diluir durante la noche el cultivo PAO1:lux a OD600 = 0,05 en 75 mL de medios de caldo de lisógeno (LB) que contengan 100 μg/mL de carbenicilina y hacer crecer la bacteria hasta que el cultivo esté en fase exponencial temprana (ED600≈0,3). Esto debería llevar aproximadamente 2–3 horas.
- Diluir PAO1:lux en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de (7,5 ± 2,5) x 102 UFC/mL. Asegúrate de preparar un inóculo excesivo para asegurar suficiente volumen y permitir el placado tras el experimento. Si transportas entre instalaciones, usa doble contención en una caja a prueba de fugas claramente marcada como Biohazard.
- Realizar todo el trabajo con P. aeruginosa y ratones utilizando equipo de protección individual aprobado en un gabinete de seguridad biológica (BSC) aprobado por el Nivel de Bioseguridad Animal 2 (ABSL-2). Los equipos reutilizables, como la báscula, deben cubrirse con film transparente para evitar la contaminación.
- Anestesiar al ratón usando isoflurano al 3%. Pesa el ratón y anota el peso. Inyectar al ratón subcutáneamente con cloruro de sodio estéril al 0,9% precalentado, 250 μL en cada flanco, para un total de 500 μL.
- Si la capa transparente del ratón se ha desprendido durante la noche, quita cuidadosamente cualquier costra y aplícate un nuevo vendaje.
- Utilice una jeringuilla de 500 μL de cápsula de seguridad de tuberculina 27 G para inyectar 40 μL de la suspensión PAO1:lux a través del apósito transparente en cada herida. Se deben usar ratones diferentes para controles de heridas no inoculados o PBS para evitar la contaminación cruzada por el lado contralateral.
- Coloca el ratón de nuevo en su jaula sobre una almohadilla térmica y monitorea hasta que despierte. Todos los ratones deben alojarse individualmente en jaulas separadas para evitar la contaminación cruzada.
- Proporciona pasta nutricional alta en calorías entre los pellets en el suelo de la jaula.