Imagen bioluminiscente de infecciones bacterianas en ratones

Resumen

Fuente: de Vries, C. R., et al., Un modelo de inoculación retardada de infección crónica de heridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demuestra una técnica de imagen bioluminiscente para monitorizar la progresión de la infección bacteriana en un modelo murino vivo. Las bacterias patógenas diseñadas con el sistema reportero luxABCDE emiten luz en el lugar de la infección, permitiendo la visualización de bacterias metabólicamente activas. Al imaginar el ratón a lo largo del tiempo, los investigadores pueden seguir de forma no invasiva la dinámica de la infección y cuantificar la intensidad de la señal bioluminiscente.

Protocolo

1. Preparación y crecimiento de bacterias

1. Realizar todo el trabajo con P. aeruginosa y animales con precauciones BSL-2 conforme a las directrices del comité institucional de bioseguridad y del comité de uso animal del investigador. Realiza todos los pasos descritos aquí que involucran P. aeruginosa, incluida la inoculación del ratón, en un gabinete de bioseguridad.
2. La cepa luminiscente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponible en nuestro laboratorio bajo solicitud. Streak PAO1, almacenado como stock de glicerol congelado, en agar de Caldo de Lisogénia (LB). Para la cepa luminiscente PAO1:lux, el agar LB debe contener antibióticos selectivos (100 μg/mL de carbenicilina y 12,5 μg/mL de kanamicina). Cultiva a 37 °C durante la noche en una incubadora bacteriana.
3. Elige una colonia aislada y cultiva durante la noche a 37 °C en 3 ml de medio de 3 ml, pH 7,4. Para cepas luminiscentes, el caldo debe contener 100 μg/mL de carbenicilina. Crece bajo condiciones de temblor y aeróbicas.

2. Preparación del procedimiento

1. Que todo el personal que realice la cirugía lleve bata limpia/bata de laboratorio, mascarilla, mosquitera para el pelo y guantes.
2. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos, incluidas tijeras y pinzas. Utiliza técnicas asépticas para esterilizar herramientas entre animales.
3. Limpia la camilla quirúrgica con etanol y prepara un campo quirúrgico limpio.

3. Depilación

1. Anestesiar ratones C57BL/6J de 8–12 semanas usando isoflurano al 1%–3%. Los investigadores deben seguir las directrices del personal veterinario de su institución para la anestesia al usar isoflurano.
   1. Comienza la anestesia administrando isoflurano entre un 1% y un 3% y ajusta el caudal de oxígeno a 1,5 L/min. Coloca el ratón en la cámara de inducción.
   2. Pellizca el dedo del pie del ratón para evaluar la profundidad de la anestesia. Cuando el ratón ya no responde a la estimulación, sácalo de la cámara de inducción y colócalo sobre el banco quirúrgico con la nariz en el cono nasal de isoflurano.
   3. Aplica lubricante ocular en ambos ojos.
2. Pesa el ratón para obtener un peso base previo al procedimiento.
3. Coloca al ratón en posición prona. Inyectar al ratón subcutáneamente con cloruro de sodio estéril al 0,9% precalentado, 250 μL en cada flanco, para un total de 500 μL.
4. Afeita la zona dorsal del ratón usando una maquinadora eléctrica. El afeitado debe realizarse en un lugar diferente al de la estación quirúrgica para evitar la contaminación del cabello en la herida.
5. Aplica una capa fina de loción depilatoria. Deja reposar la loción entre 20 y 60 segundos. Elimina el vello y el exceso de loción con gasa humedecida en agua tibia. Tras la depilación, proceda al procedimiento de escisión de lesiones.

4. Cirugía de herida excisional de grosor completo

1. Inyectar buprenorfina de liberación sostenida 0,6–1 mg/kg por vía subcutánea usando una aguja de 25 G en la zona dorsal media del ratón. La buprenorfina de liberación lenta proporciona alivio del dolor durante 48–72 horas.
2. Desinfecta el lugar quirúrgico. Limpia la superficie dorsal con un hisopo betadine estéril. Limpia el exceso de Betadine con un hisopo estéril de alcohol. Esto debe realizarse 3 veces (alternando entre betadine y alcohol), fregando desde el centro de forma circular hasta el borde. Deja que la zona se seque al aire.
3. Crea una cortina alrededor del lugar quirúrgico utilizando gasas estériles o film transparente plástico.
4. Estira la piel con caudalidad. Utiliza un punzón de biopsia cutánea estéril de 6 mm de diámetro para realizar una incisión inicial en la epidermis dorsal izquierda. Repite en la epidermis dorsal derecha.
5. Utiliza pinzas para acampar la piel desde el centro de la zona de la herida delineada por la izquierda. Extirpa las capas epidérmica y dérmica con tijeras. Repite en la zona de la herida delineada a la derecha para crear heridas excisionales simétricas.
6. Lava las heridas con 50 μL de suero estéril. Deja que el lugar quirúrgico y la piel circundante se sequen al aire. Luego, cubre las heridas y el dorso con un apósito transparente de película.
7. Coloca el ratón de nuevo en una jaula limpia. Una casa de 1 animal por jaula.
8. Coloca la jaula sobre una almohadilla y monitorea hasta que el ratón despierte.
9. Al realizar la cirugía anterior en varios animales, utiliza un esterilizador de perlas calientes para limpiar todos los instrumentos quirúrgicos entre animales.
10. Permitir 24 horas para que los ratones se recuperen del procedimiento quirúrgico y para la formación de una matriz provisional sobre las heridas antes de proceder a la inoculación con bacterias.

5. Inoculación con P. aeruginosa

1. Diluir el cultivo PAO1:lux durante la noche a OD600 = 0,05 en 75 mL de medio LB que contenga 100 μg/mL de carbbenicilina y crecer la bacteria hasta que el cultivo esté en fase exponencial temprana (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Esto debería llevar aproximadamente 2–3 horas.
2. Diluir PAO1: lux en PBS a una concentración de (7,5 ± 2,5) x 10² UFC/mL. Asegúrate de preparar un inóculo excesivo para asegurar suficiente volumen y permitir el placado tras el experimento. Si se transporta entre instalaciones (es decir, del laboratorio al vivario), utiliza doble contención en una caja a prueba de fugas claramente marcada como Biohazard.
3. Realizar todo el trabajo con P. aeruginosa y ratones utilizando equipo de protección individual aprobado en un gabinete de seguridad biológica (BSC) aprobado por el Nivel de Bioseguridad Animal 2 (ABSL-2). Los equipos reutilizables, como la báscula, deben cubrirse con film transparente para evitar la contaminación.
4. Anestesiar usando isoflurano al 3% como se ha descrito anteriormente. Pesa el ratón y anota el peso. Inyectar al ratón subcutáneamente con cloruro de sodio estéril al 0,9% precalentado, 250 μL en cada flanco, para un total de 500 μL.
5. Si la capa transparente del ratón se ha desprendido durante la noche, quita cuidadosamente cualquier costra y aplícate un nuevo vendaje.
6. Utilice una jeringuilla de 500 μL de cápsula de seguridad de tuberculina 27 G para inyectar 40 μL de la suspensión PAO1:lux a través del apósito transparente en cada herida. Se deben usar ratones diferentes para controles de heridas no inoculados o PBS para evitar la contaminación cruzada por el lado contralateral.
7. Coloca el ratón de nuevo en su jaula sobre una almohadilla térmica y monitorea hasta que despierte. Todos los ratones deben alojarse individualmente en jaulas separadas para evitar la contaminación cruzada.
8. Proporciona una pasta nutricional alta en calorías entre los pellets de comida en el suelo de la jaula.
9. Usa el inóculo restante para estirar una placa de agar LB. Cuenta las colonias para confirmar el número de bacterias administradas.

6. Imagen in vivo de heridas infectadas

1. Seguir los protocolos de contención BSL-2 para el transporte de ratones hacia y desde el instrumento de imagen, incluyendo el uso de un recipiente secundario. Ten cuidado de no transferir ni dejar caer ningún lecho de animal durante el traslado del ratón a la cámara de inducción o al instrumento de imagen.
2. Inducir anestesia del ratón con isoflurano inhalado entre un 1% y un 3% en una cámara de inducción.
3. Una vez anestesiado, el ratón se coloca en posición prona en la cámara de imagen de un sistema óptico de imagen con la nariz en el cono nasal de isoflurano.
4. Abre el programa.
5. Los parámetros de adquisición variarán en función del número de animales fotografiados simultáneamente y de la intensidad de la bioluminiscencia. Los parámetros básicos a establecer incluyen el tiempo de exposición, el binning, el f/stop y el campo de visión (FOV). Nuestros ajustes iniciales por defecto son tiempo de exposición 30 segundos, binning bajo (2), f/stop 1.2 y FOV 25. Ajusta estos ajustes según sea necesario, según las necesidades del investigador.
6. Analizar datos de luminiscencia utilizando un programa de imagen. La luminiscencia se representará como una imagen pseudocolor superpuesta sobre una fotografía en color de los ratones.
   1. Crea una región de interés (ROI) en el lugar de la herida y mide el flujo medio (fotones/segundo) detectado. Ten en cuenta que los datos también pueden reportarse como radiancia (fotones/segundo/cm²/esteradiano), pero mientras la distancia de la plataforma de imagen a la cámara se mantenga constante entre imágenes, el flujo es suficiente.
   2. Mide el fondo creando un retorno de inversión en una zona aleatoria de la plataforma de imagen. Resta el número de fondos de fotones por segundo.
   3. Exporta los datos a una hoja de cálculo para un análisis más detallado.
7. Realiza imágenes como se ha descrito anteriormente con una frecuencia diaria para seguir la progresión de la infección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inyección de cloruro de sodio al 0,9%	Hospira	2484457
18 G x 1 aguja estéril	BD	305195
25 G x 1 1/5 aguja estéril	BD	305127
Hisopo de alcohol	BD	326895
Software de Imagen de Aura	Imágenes de Instrumentos Espectrales	N/D
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
LABORATORIO DE BUPRENORFINA SR	Zoopharm	N/D
C57BL/6J ratones machos	El Laboratorio Jackson	664
Punzón desechable para biopsias, 6 mm	Integra	33-36
Tijeras finas - Carburo de tungsteno	Herramientas Científicas Fines	14568-09
Esterilizador de vidrio en seco con perlas de vidrio	Aparato de Harvard	61-0183
Agar granulado	Biorreactivos de Fisher	BP9744
Almohadilla eléctrica	Milliard	804879481218
Jeringuilla de insulina con aguja de 28 g	BD	329461
Sistema de Imagen Lago X	Imágenes de Instrumentos Espectrales	N/D
Caldo LB	Biorreactivos de Fisher	BP1426
Jeringuilla Leur-Lok 1 mL	BD	309628
Mini Arco Recortador de Animales	Wahl Professional	919152
Loción depilatoria Nair con aceite para bebés	Church y Dwight	N/D	Disponible en cualquier farmacia
Pinzas Octágonas	Herramientas Científicas Fines	11041-08
Placa de Petri	Halcón	351029
Solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Película transparente para prensar y sellar	Me alegro	N/D
Jeringa de insulina SafetyGlide con aguja de 30 G	BD	305934
Jeringuilla de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Escala	Ohaus Scout Pro	SP202
Suplemento Nutricional Suplical	Henry Schein Salud Animal	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W