Ensayo de coinfiltración para detectar efectores de patógenos que suprimen el silenciamiento del ARN vegetal

Resumen

Fuente: Shi, J., et al. Cribado e identificación de supresores silenciadores de ARN a partir de efectores secretados de patógenos vegetales. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo muestra un ensayo de coinfiltración para identificar proteínas efectoras de patógenos que suprimen el silenciamiento de ARN en Nicotiana benthamiana 16c. Un reportero fluorescente y un gen efector candidato se introducen en las hojas de las plantas a través de Agrobacterium. Normalmente, el silenciamiento de ARN degrada los transcritos reporteros, reduciendo la fluorescencia. Los efectores supresores bloquean esta respuesta, preservando la fluorescencia. Este ensayo ofrece un método rápido y visual para detectar efectores microbianos que interfieren con la defensa del huésped.

Protocolo

Coinfiltración Nicotiana benthamiana hojas

1. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contenga 35S-GFP con un cultivo de Agrobacterium que contenga 35S-supresor del virus mosaico del pepino 2b (CMV2b), efector putativo o vector vacío (EV).
2. Infiltra con cuidado y despacio las suspensiones mixtas de agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de N. benthamiana 16c usando una jeringuilla sin aguja de 1 mL.
3. Retira la suspensión bacteriana restante de las hojas con limpiaparabrisas de tejido blando y rodea los márgenes de las zonas infiltradas con un bolígrafo de fabricación.
4. Deja las plantas infiltradas en la cámara de crecimiento bajo las mismas condiciones de crecimiento.
   
   NOTA: Por razones de seguridad y salud, se deben llevar gafas protectoras y mascarilla durante la infiltración. Para evitar la contaminación cruzada, los guantes deben cambiarse o esterilizarse con etanol entre infiltraciones. Normalmente se necesitan al menos 1 mL de suspensiones de agrobacterium por hoja para la infiltración. Para el silenciamiento sistémico, se requerirán al menos dos hojas para la infiltración.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lámpara UV	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observación