Aislamiento de bacterias del intestino medio del mosquito

Resumen

Fuente: Liu, X., et al. Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo muestra la disección del intestino medio del mosquito para aislar bacterias intestinales. El intestino medio se extrae del tracto digestivo, se homogeneiza para liberar las bacterias y se coloca en el árbol de ágar nutritivo para cultivar colonias bacterianas.

Protocolo

1. Diseccionar el intestino medio del mosquito
   1. Transfiere el mosquito esterilizado en superficie sobre el portaobjetos de vidrio con una gota de suero estéril 1x tamponado con fosfato (PBS). Disecciona bajo el microscopio de disección.
   2. Bajo la menor ampliación del microscopio disecador, retira cuidadosamente las patas, alas y cabeza del mosquito para evitar la fuga. Elimina el último somite del mosquito cortándolo directamente, en lugar de tirarlo, para evitar que el tracto digestivo se rompa.
   3. Pinza el tórax del mosquito y el extremo del abdomen con pinzas. Saca suavemente el tracto digestivo del mosquito. El tracto digestivo adquirido suele contener el cultivo, el intestino anterior, el intestino medio, el posterior y los tubos de Malpighi.
   4. Ajusta el microscopio disecable a una mayor ampliación. Retira el cultivo, el intestino anterior, el intestino posterior y los tubos de Malpighi del tracto digestivo diseccionado para obtener el intestino medio del mosquito.
   5. Ten cuidado al retirar el cultivo, ya que el cultivo se infla y se parece al intestino medio después de que el mosquito consuma una harina de azúcar. Los tubos de Malpighi, un grupo de tubos excretores largos y delgados, se encuentran en el límite entre el intestino medio y el intestino posterior.
2. Aislar bacterias intestinales
   1. Transfiere el intestino medio disecado a un tubo estéril de 1,5 mL con 200 μL de buffer PBS estéril 1x.
   2. Tritura el intestino medio en un banco estéril cuidadosamente con un mano estéril para permitir la liberación completa de bacterias intestinales al amortiguador.
   3. Diluir en serie el homogeneado a tres diluciones de 10 veces. Añade 50 μL de cada dilución a la placa de agar LB (caldo Luria) y extiéndela sobre la placa. Si el intestino medio contiene una alta concentración de flora intestinal, es esencial hacer más diluciones en serie para identificar colonias individuales.
   4. Incubar la placa a 37 °C durante 1–2 días hasta que se vean colonias individuales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aedes aegypti			Hembras de mosquito
Tubo centrífuga	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 mL, natural, graduado, estéril
Mortero desechable para moler tejido	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm de largo, cónico, azul, estéril
Pinzas	RWD	F11029	Disección
Polvo de agar LB	Sangon Biotech	A507003	Triptona 10,0 g, extracto de levadura 5,0 g, NaCl 10,0 g, agar 15,0 g.
Microscopio	Zeiss	Stemi508
Búfer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Este producto es una solución 10X. Por favor, dilúyelo 10 veces antes de usarlo. El valor de pH es 7,4.