Establecimiento de una población bacteriana intestinal definida en mosquitos adultos

Resumen

Fuente: Liu, X., et al. Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demuestra el agotamiento de la microbiota intestinal nativa en los mosquitos utilizando una solución que contiene sacarosa. A esto le sigue una recolonización controlada con una suspensión bacteriana administrada a través de un sistema de alimentación por membrana para establecer una población bacteriana definida en el intestino del mosquito.

Protocolo

1. Tratamiento antibiótico y reintroducción de bacterias

1. Prepara la solución antibiótica.
   1. Pesa la cantidad requerida de sacarosa, penicilina y estreptomicina para preparar una solución al 10% de sacarosa que incluya 20 unidades de penicilina y 20 μg de estreptomicina por mL.
2. Alimenta a los mosquitos con la solución antibiótica.
   1. Anestesiar los mosquitos a 4 °C durante 3–5 minutos. Transfiere los mosquitos a un vaso de papel. Cubre la parte superior con gasas y encierra la gasa con cinta adhesiva para evitar que los mosquitos se escapen.
   2. Sumerge bolas de algodón estériles en la solución antibiótica y colócalas cuidadosamente sobre la copa mosquito. Aprieta las bolas de algodón antes de usarlas para evitar que los mosquitos se ahoguen en las bolas de algodón goteando.
   3. Cubre las bolas de algodón con una placa de Petri de 10 cm para evitar la evaporación de la humedad. Cambia las bolas de algodón dos veces al día durante tres días consecutivos.
3. Preparación de la suspensión bacteriana
4. Mide la solución bacteriana con un espectrofotómetro. Añade 1 suspensión bacteriana de diámetro exterior (OD₆₀₀) en un tubo de 1 mL. Centrifuga la suspensión a 5.000 x g durante 5 minutos a 4 °C.
5. Descarta el sobrenadante y añade 1 mL de buffer estéril de PBS 1x a un tubo de 1,5 mL para la precipitación en suspensión.
6. Centrifugar a 5.000 x g durante 5 minutos a 4 °C; Descarta el sobrenadante.
7. Repite los pasos 2.4.2 y 2.4.3.
8. Añade 200 μL de suero fisiológico estéril 1x tamponado con fosfato (PBS) a la precipitación bacteriana.
9. Añadir 600 μL de solución al 10% de sacarosa, 200 μL de 10 mm de adenosina 5′-trifosfato (ATP), que actúa como fagoestimulante, y 200 μL de suspensión bacteriana en un tubo estéril de 1,5 mL. Mezcla por vórtice.
10. Alimenta al mosquito con la suspensión bacteriana.
    1. Deja de hambre a los mosquitos durante 24 horas, permitiendo que los antibióticos se metabolicen antes de alimentar a las bacterias.
    2. Monta el sistema de alimentación por membrana.
    3. Sella la unidad alimentadora esterilizada con parafilm o, alternativamente, una membrana de colágeno.
    4. Ponte un anillo de plástico y fíjalo con parafilm para evitar que se rompa por fricción durante la alimentación.
    5. Añade lentamente la solución bacteriana preparada a la unidad de alimentación.
       Nota: Solo un pozo de la unidad alimentadora de dos pozos puede llenarse con la solución, y cubrir la unidad alimentadora solo desde el lado de la gota de reactivos.
    6. Conecta la unidad alimentadora a un sistema de alimentación precalentado a 37 °C, que simula la temperatura humana para atraer mosquitos. Coloca el dispositivo de alimentación en un vaso de papel lleno de mosquitos y alimenta durante 90 minutos.
    7. Después de alimentarse, anestesiar a los mosquitos sometiéndolos a una temperatura de 4 °C durante 3–5 minutos y mantenerlos anestesiados en una placa de Petri bien fría.
    8. Elige los mosquitos completamente inflamados para estudios posteriores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hidrato de sal sódica 5′-trifosfato de adenosina	Sigma	A2383	Se ha utilizado la adenosina 5′-trifosfato sal-disódico hidrato para preparar soluciones estándar de adenosina trifosfato (ATP)
Sistema de alimentación por membrana Hemotek	Hemotek		Componentes del sistema de alimentación, incluyendo el controlador de temperatura Hemotek, el conjunto de la carcasa del alimentador, el alimentador metálico ensamblados.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 in x 125 ft
Placa de Petri	Sangon Biotech	F611203
Hidratación de sal de penicilina G	Sangon Biotech	A606248	Polvo blanco. Soluble en agua, soluble en metanol, ligeramente soluble en agua, etanol
Sulfato de estreptomicina	Sangon Biotech	A610494	El sulfato de estreptomicina es un antibiótico glucosaminérgico que interfiere con la síntesis de proteínas procariotas.
Sacarosa	Sangon Biotech	A502792	Soluble en agua, etanol y metanol, ligeramente soluble en glicerol y piridina.
Búfer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Este producto es una solución 10X. Por favor, dilúyelo 10 veces antes de usarlo. El valor de pH es 7,4.