Imágenes en vivo de la muerte celular de los macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra

Resumen

Fuente: Niu, L., et al. Visualización de la muerte celular lítica de macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra mediante microscopía intravital. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra el uso de microscopía confocal intravital para visualizar la muerte lítica de los macrófagos en embriones de pez cebra tras una infección por Mycobacterium marinum .

Protocolo

1. Imágenes en vivo de la infección

1. 1. Montaje de peces para imágenes en vivo
   1. Transfiere hasta 10 embriones anestesiados con tricaína al centro de un recipiente de fondo de cristal de 35 mm. Descarta el extra de E3 media.
   2. Cubre el plato con agarosa al 1% de punto de fusión bajo y orienta cuidadosamente los embriones de pez cebra usando una aguja de 10 G. Incuba el recipiente de cristal sobre hielo durante 10 segundos para solidificar la agarosa.
      NOTA: Para la inyección del mesencéfalo, los embriones deben montarse en la agarosa con la cabeza orientada hacia arriba (Figura 1A).
   3. Una vez que se haya solidificado completamente, cubre la agarosa con una capa de agua de huevo (más 1 x tricaína y PTU (N-feniltiourea)).
2. Microscopía confocal de alta resolución y lapso de tiempo de tres colores
   NOTA: Los siguientes pasos se operan con una microscopía confocal equipada con una lente objetivo UV de aceite de 63,0x 1,40.
   1. Ajusta la temperatura de la cámara ambiental a 28,5 °C. Coloca papel de seda húmedo dentro de la cámara para proporcionar humedad y evitar la evaporación del agua del huevo.
   2. Coloca el plato de fondo de cristal de 35 mm con el pez cebra en la cámara ambiental.
   3. Abre el software de confocal e inicializa la etapa. Cambia al objetivo UV de aceite de 63,0 x 1,40 y localiza el pez cebra usando el canal de campo brillante con un filtro de contraste de interferencia diferencial (DIC).
   4. Abre el diodo de 405, argón (20% de potencia) y el láser DPSS de 561 nm. Configura la potencia láser y los ajustes de espectro adecuados.
      NOTA: A continuación se muestran los ajustes de espectro para Cerúleo (excitación = 405 nm; emisión = ~456–499 nm), eGFP (excitación = 488 nm; emisión = ~500–550 nm), DsRed2 (excitación = 561 nm; emisión = ~575–645 nm)
   5. Elige el modo de adquisición "XYZ" y "Escaneo secuencial" y configura el formato de imagen en "512 x 512 píxeles".
   6. Cambia a "Modo de Datos en Vivo". Apunta a la posición del primer pez cebra y marca la posición "Inicio" y "Fin" Z. Repite este proceso para cada uno de los embriones restantes. Se puede añadir una "pausa" al final del programa.
   7. Define el bucle y el ciclo del programa.
   8. Guarda el archivo.

Resultados

Figura 1: Montar embriones de pez cebra para imágenes vivas. (A) Para la infección del mesencéfalo, los embriones de pez cebra se montaban con la cabeza orientada hacia abajo. (B) Para la infección de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Un plato de 35 mm con fondo de cristal	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Microscopio confocal	Leica	TCS SP5 II
Cámara Ambiental	Pecon	Control de temperatura 37-2 digital
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-feniltiourea (PTU)	Sigma	P7629