Evaluación in vitro de la muerte bacteriana por fagocitos esplénicos neonatales de ratón

Resumen

Fuente: Seman, B. G., et.al. Modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana Gramnegativa. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demuestra el aislamiento de neutrófilos y monocitos inflamatorios de bazos neonatales de ratón y su aplicación en un ensayo luminiscente de eliminación bacteriana. Cubre la disociación mecánica, la lisis de glóbulos rojos, el enriquecimiento celular basado en perlas magnéticas, la incubación bacteriana y la protección con antibióticos. Las lecturas de luminiscencia temporizadas indican la internalización bacteriana inicial seguida de una eliminación mediada por el sistema inmunológico.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Ensayo in vitro para matar bacterias

1. Retira el bazo de un cachorro neonatal no infectado y colócalo en una cesta de nailon de 40 μm dentro de una placa de Petri estéril de 60 mm. Repite esto y agrupa los bazos en un solo tubo para que se extraigan y homogeneizen juntos.
2. Añadir 5 mL de suero salino con fosfato (PBS) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS).
3. Desagrega el tejido con un émbolo de jeringuilla estéril de 3 mL hasta que se forme una suspensión de una sola célula.
4. Recoge la suspensión de célula única fuera de la cesta de nylon, transfiere a un tubo de centrífuga de 15 mL y aplica las celdas de pellet a 350 x g durante 5 minutos.
5. Suspende las células en un buffer de lisis de glóbulos rojos (2 mL para hasta 7-8 bazos) y déjalo reposar 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los eritrocitos.
6. Lava los esplénocitos con PBS y pellets como antes.
7. Suspender los esplénocitos en 0,25 mL de PBS suplementados con 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA según el rendimiento celular esperado.
8. Cuenta los esplénocitos utilizando un hemocitómetro u otra aplicación adecuada.
9. Aislar las células de Ly6B.2⁺ (población mieloide de granulocitos/monocitos inflamatorios) con perlas inmunomagnéticas.
10. Semillar celdas Ly6B.2⁺ a una densidad de 1 x 10,5 celdas por pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos en un volumen de 0,1 mL de DMEM que contiene 10% FBS, 2 mM glutamina y 25 mM HEPES (medio completo).
11. Enumerar E. coli bioluminiscente y preparar el inóculo bacteriano a la multiplicidad deseada de infección (MOI) en un volumen final de 0,1 mL. Esto se consigue mejor haciendo lo necesario para todos los pozos en un MOI común en lotes.
12. Añade 0,1 mL de inóculo bacteriano o medio completo solo como control. Incubar la placa de varios pozos a 37 °C y 5% de_CO2 durante 1 hora.
13. Sustituye el medio por 0,2 mL de medio completo y fresco que contenga gentamicina (100 μg/mL) retirando suavemente el medio con una pipeta y añadiendo material fresco con una punta nueva de la pipeta. Devuelve el cultivo a incubación durante 2 horas adicionales.
14. A las 3 horas de la infección, mide la luminiscencia en cada pozo de la placa de cultivo tapada desde la parte inferior usando un lector de placas y luego devuelve el cultivo a la incubación.
15. Repite las mediciones de luminiscencia en otros momentos deseados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Búfer de lisis ACK	Gibco	LSA1049201	Ensayo de eliminación bacteriana
Microperlas anti-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Aislamiento celular
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresa luciferasa)	N/A	N/A	Construido internamente en WVU
Buffer de aislamiento	Miltenyi Biotec	N/A	Ensayo de eliminación bacteriana
LB Broth, Lennox	Biorreactivos de Fisher	BP1427-500	Crecimiento bacteriano
Culeador EASYstrainer (Cesta de nailon)	Greiner Bio-one	542 040	Colador celular
SpectraMax iD3	Dispositivos moleculares	N/A	Lector de matrículas