Modelado de la infección en ratones neonatales utilizando bacterias bioluminiscentes encapsuladas

Resumen

Fuente: Seman, B. G., et al. Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gramnegativa. J. Vis. Exp. (2020)

El vídeo muestra un modelo neonatal murino para estudiar la infección sistémica utilizando bacterias bioluminiscentes encapsuladas. A los cachorros neonatales se les inyectan suspensiones bacterianas de dosis altas o bajas y se les devuelven a su madre para cuidados postnatales. Las bacterias encapsuladas evaden la detección inmunitaria temprana, se propagan sistémicamente y se visualizan con el tiempo mediante imágenes por luminiscencia. Este modelo permite el seguimiento no invasivo de la progresión de la infección en ratones neonatales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Preparación del inóculo bacteriano

1. Estirar una placa de agar de soja tríptico (TSA) con un lazo inoculante para aislar una sola colonia de un stock congelado de Escherichia coli O1:K1:H7-lux que expresa de forma estable la luciferasa y conserva resistencia a la kanamicina. Incubar durante la noche a 37 °C.
2. Al día siguiente, deja que el caldo Luria (LB) alcance la temperatura ambiente (25 °C) en un armario de bioseguridad.
3. Bajo una capucha de gabinete de bioseguridad, identifica una sola colonia de la placa rayada e inocúlala en 3 mL de LB suplementados con kanamicina (30 μg/mL). Incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 220 revoluciones por minuto (rpm). Esta es la cultura de inicios.
4. Diluye el cultivo inicial 1:100 en un nuevo 3 mL de LB bajo una campana de bioseguridad y devuelvo a la incubadora durante 2-3 horas a 37 °C con agitación (220 rpm). Esta es la cultura de stock.
5. Lee la densidad óptica (OD) tanto del cultivo en blanco como del material estándar a 600 nm usando un espectrofotómetro. Añadir 100 μL de LB (sin bacterias) en un pozo de una placa de ensayo de fondo plano de 96 pozos; Esto es el vacío. Luego añade 100 μL del cultivo de material a un pozo separado. Repite para dos réplicas adicionales. La absorbancia se lee mediante un lector de placas.
6. Resta la absorbancia en blanco del valor de absorbancia del cultivo stock (el valor OD) y compáralo con una curva de crecimiento generada y validada previamente para determinar una aproximación de la densidad bacteriana en el cultivo stock para la preparación de la dosis infecciosa.
7. Genera inóculos objetivo según la pregunta de investigación. Para este estudio se utilizaron inóculos objetivo de 2 unidades formadoras de colonias (CFU) de 2 x 10⁶ (baja) y 7 de 10⁶ (alta) por ratón (/ratón).
   1. Divide la dosis objetivo por ratón (DoseT) por la concentración estimada de bacterias en el cultivo stock (Stock) para obtener el volumen de bacterias necesario del tubo stock (VS).
   2. Multiplica el VS por el número de ratones (NM) que necesitan ser infectados, junto con suficiente para 5-10 extras, para la cantidad total de bacterias necesarias para la infección, más 5-10 dosis adicionales. Quita este volumen del tubo original y añádelo a un tubo de centrífuga nuevo.
   3. Utiliza la ecuación siguiente: DoseT/Stock = VS x NM = volumen total (VT) de bacterias que se van a extraer del tubo original.
8. Centrifugar la bacteria a 2.000 x g durante 5 minutos a 4 °C y volver a suspender el pellet bacteriano en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2-7,6) por ratón a infectar (por ejemplo, para 10 dosis de 2 bacterias de 10⁶ por dosis, el pellet de 2 bacterias 10⁷ se resuspendería en 500 μL PBS). De nuevo, se recomienda preparar más inóculo del necesario. Prepara un volumen igual de PBS solo para las inoculaciones de control. Mantén el control del inóculo infeccioso y el PBS en hielo hasta la infección.
9. Realizar siete diluciones en serie de diez veces en PBS en una placa de dilución de fondo plástico de 96 pozos, y la placa de 25 μL de las diluciones en duplicado en placas TSA en cuadrantes suplementadas con kanamicina (30 μg/mL) para enumerar la cantidad real de bacterias administradas. Incubar a 37 °C durante la noche para la formación de la colonia antes de la enumeración.

2. Identificación animal

1. Organizar un número suficiente de parejas reproductoras para que las camadas puedan sincronizarse para cachorros de edad similar. La variabilidad de edad de ± día es aceptable.
2. Identificar una ratona embarazada C57BL/6 y monitorizar el nacimiento de la camada antes del experimento previsto para determinar con precisión la edad.
3. Para distinguir entre cachorros de control e infectados de 3 o 4 días, utiliza un par de tijeras pequeñas de punta fina para cortar solo los extremos de las colas de los cachorros de control. Los cachorros infectados no reciben tijeras de cola. Antes de cortar la cola, desinfecta la piel con un algodón empapado con etanol al 70%. Aplica presión en el extremo de la cola con una bola de algodón o una gasa según sea necesario.
   NOTA: Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad. Un corte de cola de aproximadamente 1/8 de pulgada es suficiente.
4. Para identificar a los cachorros dentro de los grupos control e infectados, utiliza una jeringuilla de insulina de 1 mL con una aguja permanente de 28 G x 1/2'' para tatuar las colas de los cachorros. Antes de tatuar, desinfecta la piel con una bola de algodón rociada con un 70% de etanol. Este procedimiento se realiza bajo una campana de gabinete de bioseguridad.
5. Para tatuar la cola, aplica tinta de tatuaje animal en la punta de la aguja. Después, sujeta cuidadosamente al cachorro con una mano, dejando la cola completamente expuesta. Inserta suavemente la aguja bajo la piel, manteniendo un nivel superficial de profundidad, y mueve la aguja paralela a la piel unos milímetros hasta que se forme una pequeña marca, o punto. Espera unos segundos antes de retirar lentamente la aguja de debajo de la piel, para evitar que se libere el exceso de tinta por debajo de la piel.
6. Aplica presión sobre la herida con un algodón o gasa según sea necesario. Elimina el exceso de tinta de tatuaje de la superficie de la piel con etanol al 70%.
7. Repite este proceso con ratones posteriores en los grupos infectado y de control, añadiendo un punto adicional con cada cachorro tatuado (por ejemplo, el cachorro 1 tendrá un punto en la cola, el cachorro 2 tendrá dos puntos en la cola, etc.).
   NOTA: Para una capa adicional de identificación, se recomienda usar colores separados de tinta de tatuajes de animales para los grupos de control y de infectados.

3. Inoculación subescapular

NOTA: Para este estudio, se realizaron 2 experimentos con un grupo de dosis baja y otro de dosis alta designados para cada experimento. En el primer experimento, se administró el inóculo de baja dosis a 7 crías (se usaron 4 crías como controles) y a 5 crías de una camada separada se les administró la dosis alta (se usaron 3 crías como controles). Los cachorros del experimento 1 proporcionaron datos solo para el punto temporal de 24 horas. En el segundo experimento, se administró el inóculo de baja dosis a 8 cachorros (se usaron 2 cachorros como controles) y a 6 cachorros se le administró el inóculo de dosis alta (se usaron 2 cachorros como controles). Los cachorros del experimento 2 proporcionaron datos para los puntos de 0, 10 y 24 horas.

1. Cachorros de edad coincidente ≤ 1 día. Asigna cada camada como una camada de baja o alta dosis. Dentro de una camada, asigna aleatoriamente a los cachorros como control o como cachorros infectados.
2. En el día 3 o 4 posnatal, anota el peso de todos los cachorros antes de la inoculación con E. coli-lux o el control PBS. Separa a la madre de los cachorros durante este tiempo para asegurarte de que no se muevan durante la infección.
3. Dentro de un gabinete de bioseguridad usando una aguja de insulina, aspira PBS o el inoculo de E. coli-lux . Para este trabajo se utilizaron inóculos de 2 x 10⁶ y 7 UFC de 10⁶ por ratón. Conserva tanto el inóculo infeccioso como el PBS en hielo hasta la administración mediante inyección subescapular.
4. Coloca al recién nacido sobre una superficie limpia dentro de la capucha del armario de bioseguridad y eleva la piel en la nuca como si quisieras abrazar al cachorro.
5. En el espacio que ahora se crea entre la piel y el músculo del animal, inserta la aguja, bisela, justo debajo de la piel, e inyecta 50 μL de PBS o E. coli-lux. Libera simultáneamente la parte pellizcada de la piel para evitar el reflujo de inyección.
6. Retira la aguja despacio y con cuidado. Coloca a los cachorros de nuevo con las madres después de terminar las inyecciones. NOTA: Debido a su etapa anatómica en el desarrollo, es técnicamente complicado administrar una inyección en la vena caudal o intraperitoneal a crías neonatales en los días 3-4. Por ello, se eligió la vía de la infección subescapular para este estudio debido a la facilidad de ejecución.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL de jeringuilla de insulina	Coviden	1188128012	Inyección de inóculo o PBS
Pasta de tinta para tatuajes de animales	Ketchum	KI1482039	Identificación animal
Pasta verde de tinta para tatuajes de animales	Ketchum	KI1471039	Identificación animal
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresa luciferasa)	N/A	N/A	Construido internamente en WVU
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Agar de soja Difco Triptic	Becton, Dickinson y Compañía	236950	Crecimiento bacteriano
Software de TAC e Imagen Viva 4.5 del espectro IVIS	Perkin Elmer	N/A	Imagen intravital
LB Broth, Lennox	Biorreactivos de Fisher	BP1427-500	Crecimiento bacteriano