Detección in situ de bacterias en secciones de tejido gingival de ratón

Resumen

Fuente: Choi, Y. S., et al. Detección in situ de bacterias en tejidos incrustados en parafina mediante una sonda de ADN marcada con digoxina que apunta al ARNr 16S. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demuestra la detección in situ de bacterias en secciones de tejido gingival de ratón utilizando sondas de ADN marcadas con digoxinas que atacan el ADN bacteriano. La sección se incuba con la sonda. Se añaden anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina específicos a la digoxina. Se inactivan fosfatasas endógenas y se obtiene un precipitado coloreado mediante la adición de sustrato. La sección se contrateñe, se deshidrata, se elimina con xileno y se monta antes de la visualización microscópica de las bacterias.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Preparación de la sonda

1. Amplificación por PCR de la sonda
   1. Para la sonda específica de Porphyromonas gingivalis, amplificar un fragmento de ADN de 343 pb del ARNr 16S de P. gingivalis mediante PCR utilizando el ADN genómico de P. gingivalis y los siguientes cebadores: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' y 5' - ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Realiza amplificaciones con las siguientes condiciones de ciclo: 35 ciclos a 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min 20 s, seguido de una extensión de 5 min a 72 °C.
   2. Amplificar la sonda eubacteriana utilizando un fragmento de ADN de 70 pb (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCGTCAGCTCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCCCGCGCGCAGGAGCGAACCC-3') sintetizado como oligonucleótido y los siguientes cebadores: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' y 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Realiza amplificaciones con las siguientes condiciones de ciclo: 40 ciclos a 94°C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min 20 s, seguido de una extensión de 5 min a 72 °C.
   3. Precipitar los productos de la PCR (≥500 μl) añadiendo 3 M de acetato de sodio (pH 5,2) y etanol al 100% (en una proporción 10:1:2) y incubar a -20 °C durante 2 horas.
   4. Centrifugar la mezcla a 14.000 x g durante 15 minutos, resuspender el pellet en 100 μl de ácido tetraacético Tris-etilendediamina (EDTA) o tampón TE, y medir la concentración de ADN mediante densidad óptica a 260 nm.
2. Marcado de digoxigenina (DIG) utilizando un kit de marcaje y detección de ADN DIG
   1. Mezcla 3 μg de la sonda con agua hasta un volumen final de 15 μl.
   2. Desnaturaliza el ADN a 95 °C durante 10 minutos y enfría rápidamente sobre hielo.
   3. Añadir 2 μl de mezcla hexanucleótidica 10x, 2 μl de mezcla marcadora de trifosfato desoxinucleósido (dNTP) y 1 μl de enzima Klenow a 15 μl del ADN desnaturalizado.
   4. Mezcla e incuba a 37 °C durante 24 h a 48 h, y detiene la reacción calentando a 65 °C.
3. Comprueba la sensibilidad de la sonda marcada con DIG utilizando un kit de marcaje y detección de ADN DIG
   1. Carga manualmente 1 μl de diluciones en serie de la sonda de control positivo incluida en el kit y 1 ng de la sonda etiquetada con DIG sobre la membrana de nailon y seque durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
   2. Remojemos brevemente la membrana en 2x tampón de suero fisiológico-citrato de sodio (SSC) (0,3 M cloruro de sodio o NaCl, 30 mM de citrato de sodio, pH 7,0) e incuba la membrana a 80 °C durante 1 hora para inmovilizar el ADN.
   3. Remojar brevemente la membrana en un tampón de ácido maleico (MAB, 0,1 M ácido maleico, 0,15 M NaCl, pH 7,5) e incubar con anticuerpo anti-DIG fosfatasa alcalina (AP) conjugado diluido (1:5.000) en 6 ml de solución bloqueante proporcionada en el kit en RT durante 30 minutos.
   4. Lava la membrana con MABT (MAB que contiene 1% Tween 20) y aplica 40 μl de la solución de tetrazolio nitro-azul/5-bromo-4-cloro-3'-fosfato de indolil (NBT/BCIP) mezclada con 2 ml de tampón de detección (0,1 M tris(hidroximetil)aminometano cloruro o Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M cloruro de magnesio o MgCl₂, pH 9,5) sobre la membrana durante 1 minuto. Si la sensibilidad de la sonda etiquetada no es satisfactoria, repite los pasos de 1.1.3 a 1.3.4.
   5. Mide la concentración de ADN de la sonda marcada (OD₂₆₀) y ajusta la concentración a 100 ng μl-1.
4. Comprueba la especificidad de la sonda etiquetada como DIG
   1. Desnaturalizar muestras de ADN genómico (25 ng 3 μl-1 por muestra) de diversas especies bacterianas, incluida la bacteria objetivo de la sonda específica, a 95 °C durante 10 minutos y enfriarlas rápidamente sobre hielo.
   2. Carga manualmente el ADN desnaturalizado en la membrana de nailon y sécalo durante 20 minutos en RT.
   3. Remojad brevemente la membrana en 2x SSC buffer e incuba la membrana a 80 °C durante 2 horas para inmovilizar el ADN.
   4. Bloquea la membrana con una solución bloqueante en RT durante 1 hora.
   5. Diluir la sonda a 1 ng μl-1 en un tampón de hibridación, desnaturalizar las sondas diluidas y aplicarlas sobre la membrana.
   6. Incuba la membrana a 45 °C durante 1 hora.
   7. Lava la membrana tres veces con 2 buffers SSC.
   8. Deja un breve remojo de la membrana en MAB.
   9. Incubar con anticuerpo conjugado anti-DIG AP diluido (1:2.000) en 6 ml de solución bloqueante en RT durante 1 hora.
   10. Lava la membrana con MABT y aplica 40 μl de la solución de NBT/BCIP mezclada con 2 ml de tampón de detección.
   11. Cuando la sonda no alcanza la especificidad esperada, se incrementa la temperatura de hibridación hasta que se observe dicha especificidad.

2. Hibridación in situ

Nota: Para evitar el sequeo de las muestras y los reactivos, realiza todas las incubaciones en una cámara humidificada revestida con toallas de papel húmedas.

1. Desparafinización y rehidratación de secciones tisulares
   1. Preparar secciones de tejido de 4 μm de grosor a partir de bloques incrustados en parafina. El formalino, el paraformaldehído y el fijador a base de zinc son compatibles con este protocolo.
   2. Prepare todos los reactivos utilizando agua tratada con pirocarbonato dietílico (DEPC).
   3. Calienta las láminas en un horno seco a 60 °C durante 30 minutos y las láminas incubadas a RT durante 30 minutos.
   4. Sumerge los portaobjetos en xileno 100% durante 5 minutos y tres veces; Usa xileno nuevo cada vez.
      Nota: Realiza este procedimiento de descerado en una campana extractora química.
   5. Sumerge las láminas en etanol 100% durante 5 minutos dos veces, usando tanol fresco cada vez, y rehidrata las muestras en soluciones de 90%, 80% y 70% de etanol durante 5 minutos cada una.
   6. Sumerge las láminas en agua tratada con DEPC durante 1 minuto y las lavas en solución salina tamponada con fosfato o PBS (pH 7,4) tratada con DEPC durante 6 minutos.
2. Pretratamientos de secciones tisulares
   1. Sumerge los portaobjetos en ácido clorhídrico de 0,1 N durante 20 minutos y lava los portaobjetos en agua tratada con DEPC durante 30 segundos.
   2. Dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de los ejemplares usando un bolígrafo de cera.
      Nota: El tamaño de la barrera hidrofóbica depende del tamaño de los ejemplares. Por lo tanto, los volúmenes de reactivos utilizados en los siguientes pasos varían según el tamaño de las muestras, pero deben rellenar la barrera hidrofóbica (50 μl para muestras pequeñas y 400 μl para muestras grandes).
   3. Tratar muestras con 50 a 400 μl de proteinasa K (1 a 10 μg ^ml-1 en PBS tratado con DEPC) en un horno seco a 37 °C durante 30 minutos y lavar las láminas en PBS tratado con DEPC 1x durante 1 minuto.
   4. Remojas en un 4% de paraformaldehído en PBS tratado con DEPC durante 10 minutos, luego lavar las láminas en PBS tratado con DEPC durante 1 minuto.
   5. Remojo las láminas en 0,1 M trietanolamina-HCl (pH 8,0) que contienen 0,5% de anhídrido acético durante 20 minutos y lava las láminas en agua tratada con DEPC durante 30 segundos.
3. Hibridación con la sonda y lavado
   1. Sumerge las diapositivas en 2x SSC buffer durante 20 minutos.
   2. Diluir la sonda a 1 ng ^μl-1 en buffer de hibridación (4x SSC, 50% [vol/vol] formamida, 1x solución de Denhardt, 10% [wt/vol] sulfato de dextrano, 0,1% [wt/vol] dodecil sulfato sódico, 0,4 mg ml 1 ADN de esperma de salmón). Para controles negativos, mezcla la sonda marcada con una cantidad de prueba no etiquetada de 10 veces más.
   3. Desnaturalizar las sondas diluidas y aplicar entre 50 y 400 μl sobre las secciones de tejido. Coloca una cubierta en la corredera y sella con esmalte de uñas.
   4. El calor se despliega en la máquina de PCR a 90 °C durante 10 minutos y las láminas de incubación en una cámara humidificada durante la noche (O/N) a 45 °C o temperatura óptima determinada en el paso 1.4.11.
   5. Enfría las láminas a 4 °C durante 30 minutos, quita las tapas y sumerge las láminas en un buffer SSC serial de la siguiente manera: 4 SSC durante 10 minutos, precalentado (45 °C), 2 SSC durante 20 minutos, 2 SSC durante 10 minutos y 0,2x SSC durante 10 minutos.
4. Detección con anticuerpo conjugado anti-DIG AP
   1. Lava las diapositivas en MABT durante 5 minutos.
   2. Bloquea con 50 a 400 μl de solución bloqueante con 1% Tween 20 durante 20 minutos.
   3. Añadir de 50 a 400 μl de anticuerpo anti-DIG-AP diluido en solución bloqueante (1:1.000) e incubar a 37 °C durante 90 minutos.
   4. Lava las diapositivas en MABT durante 10 minutos.
   5. Sumerge las diapositivas en un buffer de detección que contiene un 1% Tween 20 durante 5 minutos.
   6. Trate con 50 a 400 μl de 1 mM de levamisol (en un tampón de detección que contiene 1% Tween 20) durante 5 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina endógena.
   7. Distribuir entre 50 y 400 μl de la solución premezclada de NBT/BCIP (diluida en tampón de detección a 1:100) sobre cada muestra e incubar las láminas en una cámara humidificada a RT durante 2 a 3 horas hasta que la señal revelada sea satisfactoria.
   8. Enjuaga las láminas con agua desionizada para detener la visualización y aplica entre 50 y 400 μl de verde de metilo al 0,05% [peso/vol] como contratinción a 37 °C durante 10 minutos.
   9. Enjuaga las láminas con agua desionizada, deshidrata en etanol 100% y sumerge en xileno.
   10. Aplica 80 μl de solución de montaje en cada corredera y tapa con las escobitas de la tapa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anhídrido acético	Sigma	6404
Solución de sulfato de Dextrano al 50%	Millipore	S4030
La solución de 50X Denhardt	Sigma	D2532
Pirocarbonato dietílico (DEPC)	Sigma	P159220
Kit de marcaje y detección de ADN de digoxigenina (DIG)	Roche	11 093 657 910
Formamida	Sigma	F9037
Pluma ImmEdge™	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Cloruro de magnesio	Sigma	246964
Ácido maléico	Sigma	M0375
Verde de metilo	Sigma	M6776
Paraformaldehído	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Solución de ADN de esperma de salmón	Invitrogen	#15632-011
Cloruro de sodio	Sigma	S9625
Citrato de sodio	Duksan	D1420
Dodecilo sulfato de sodio	Amresco	227
Trietanolamina-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Orgánicos de investigación	3098T