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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.
Visualización de la infección con bioluminiscencia
- Para visualizar el progreso de la infección, se introduce un operón bioluminiscente cromosómico (luxCDABE) en las cepas de Pseudomonas aeruginosa PGN5 y VE2 analizadas. Los plásmidos y el protocolo utilizados para marcar estas cepas se desarrollaron en el laboratorio de Schweizer y pueden no ser compatibles con todas las especies o cepas de bacterias. Es importante destacar que la visualización de la infección es opcional; por lo tanto, no es necesaria la inserción genómica de este operón para realizar el estudio de mortalidad.
- Prepara y valida las cepas. Además, comprueba la bioluminiscencia en cepas marcadas en cada paso de validación.
- Después de preparar las cepas, inyecta los animales en grupos de 10 con las cepas bioluminiscentes siguiendo los pasos anteriores.
- Fotografía a los animales cada 3 horas durante 24 horas utilizando un sistema de imagen animal capaz de bioluminiscencia.
- Primero, prepara el generador configurando los parámetros de la cámara y calentando el escenario para los animales. Luego, ajusta el flujo de oxígeno a 1,5 L por minuto (o sigue las recomendaciones del fabricante).
- Una vez estabilizado el sensor y la etapa, colocar un ratón en la cámara de anestesia inmediatamente después de la inyección y administrar isoflurano al 3,5% en la cámara con flujo deO2 durante unos 4 minutos. Los métodos de anestesia pueden variar según la cámara y/o el agente anestésico utilizado; Sigue las recomendaciones del fabricante. Determinar la anestesia adecuada mediante la prueba de reflejo de abstinencia.
- Mueve el ratón a la etapa estabilizada por temperatura. Coloca al ratón boca arriba con los brazos extendidos y coloca un cono nasal para administrar un 2,5% de isoflurano durante todo el procedimiento de imagen.
- Cierra la puerta y toma imágenes bioluminiscentes y radiografías del ratón.
- Cuando termines la imagen, devuelvo al ratón a su jaula y vigílalo. El ratón debería recuperar la conciencia en 3-5 minutos.
- Sigue tomando imágenes de ratones cada 3 horas durante 24 horas, cada vez usando un ratón diferente de cada grupo. No re-hacer la imagen de un ratón en un plazo de 24 horas debido a la posibilidad de efectos adversos por la reexposición a la anestesia. Un solo ratón solo debe recibir una dosis de anestesia cada 24-36 horas. Limpia la plataforma de imagen después de cada imagen del ratón. Apaga el generador de imágenes entre los momentos de la imagen.
NOTA: La bioluminiscencia se desvanece, independientemente de la cepa inyectada. La intensidad y longevidad de la bioluminiscencia variarán en función de muchos factores, incluyendo el número de bacterias inyectadas, la cepa de ratón, la cepa bacteriana, etc.