Visualización de la infección del tracto urinario en un modelo murino usando bioluminiscencia

Resumen

Fuente: Luyts, N., et al. Seguimiento longitudinal de infecciones urinarias y su tratamiento en ratones mediante imagen bioluminiscencia. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo muestra la inducción y seguimiento de la infección urinaria en un modelo murino utilizando E. coli bioluminiscente inyectada en la vejiga, donde ocurren adhesiones, invasión y replicación intracelular bacteriana. La luz emitida por el operón bioluminiscente sirve como marcador en tiempo real de la carga bacteriana durante la progresión de la infección.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Inoculación de los animales

1. Preparación de los animales
   1. Elige la(s) cepa(s) de ratón deseada(s) en función de la pregunta de investigación y la disponibilidad de líneas knock-out, detalles experimentales y diferencias en la susceptibilidad a las ITU. Ten en cuenta que la cateterización transuretral es más fácil en ratones femeninos. No uses animales menores de 8 semanas, ya que son inmunológicamente inmaduros. Aquí se utilizaron ratones hembras C57Bl/6J de 12 semanas.
   2. Pide a los animales con antelación y deja que se aclimaten, idealmente durante 7 días. Agrupan a los animales en jaulas ventiladas individualmente, bajo condiciones estándar de 12 horas de luz y oscuridad.
   3. Afeita la región abdominal de los animales para limitar la pérdida de señal. No uses crema depilatoria, ya que puede quemar la piel de los animales rápidamente. Sujeta al animal sujetando firmemente la barba y las patas traseras con la mano no dominante mientras te afeitas con la mano dominante. Alternativamente, afeitase bajo anestesia isoflurana.
      NOTA: Los animales se afeitaron dos días antes de la imagen, considerando que los animales acicalarán aún más la zona afeitada.
   4. Proporciona agua y comida estándar de forma espontánea durante todo el experimento. Sin embargo, privar a los animales de agua 2 horas antes de la instillación para minimizar el volumen de la vejiga durante la instillación.
   5. Monta una punta estéril de 24 g de angiocateter en una jeringuilla de 100 μL y llena la jeringuilla con la solución bacteriana.
      NOTA: Para determinar la luminiscencia de fondo, obtén una imagen de referencia antes de la instalación (véase el paso 2, más abajo).
2. Instalación de los animales
   1. Coloca a los animales en una cámara de inducción y anestesiácelos usando inhalación de isoflurano con oxígeno puro como gas portador (inducción al 3% y mantenimiento al 1,5%).
   2. Coloca un animal sobre una superficie de trabajo en posición supina y mantén una anestesia de isoflurano estable usando un cono nasal durante la instillación. Aplica la pomada para los ojos.
   3. Expulsa la orina residual aplicando una compresión suave y realizando movimientos circulares en la región suprapúbica. Limpia la parte baja del abdomen con etanol al 70% antes de la instillación.
   4. Lubrica la punta del catéter con solución salina normal. Coloca el dedo índice de la mano no dominante sobre el abdomen y empuja suavemente hacia arriba. Comienza la cateterización de la uretra en un ángulo de 90° (verticalmente) y, una vez que se encuentre resistencia, inclínala horizontalmente antes de introducirla más (0,5 cm).
      NOTA: Nunca empujes el catéter con fuerza, ya que esto dañaría la uretra. Los movimientos suaves de giro pueden ser útiles en la inserción de un catéter. Por otro lado, la falta de resistencia suele indicar una inserción errónea en la vagina.
   5. Realizar una instillación lenta (5 μL/s) de 50 μL del inóculo bacteriano (2 x 10⁷ UFC).
      NOTA: Volúmenes más altos o una instillación más rápida pueden causar reflujo en los riñones. Durante la práctica de la técnica, se puede utilizar tinta azul para evaluar el reflujo.
   6. Después de la instillación, mantén la jeringuilla y el catéter en su sitio unos segundos más y luego retrae lentamente para evitar fugas. Registra cualquier irregularidad como una alta cantidad de fugas o un meato con sangre y excluye a los animales, si es necesario.
   7. Coloca al animal en posición supina en el cono nasale de la cámara de imagen y repite los pasos anteriores 1.1.1-1.1.6 para todos los animales restantes. Usa un catéter por grupo experimental. Asegúrate de que la anestesia continúe y minimiza el tiempo entre el primer y el último animal.
   8. Si es necesario, administra antibióticos o fármacos experimentales antes o después de la imagen (paso 2). Por ejemplo, para administrar enrofloxacina, añadir 40 μL de la solución de enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL de solución fisiológica para obtener una dilución de 1/100. Inyectar 100 μL/10 g por vía subcutánea a las 9:00 y a las 17:00 para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina dos veces al día durante 3 días.

2. Imagen por bioluminiscencia

1. Preparación y selección de parámetros de imagen
   1. Abre el software de adquisición BLI (véase Tabla de Materiales) y haz clic en Inicializar en el dispositivo de imagen (véase Tabla de Materiales) para probar el sistema de cámara y controlador de escenario y enfriar la cámara CCD a -90 °C.
      NOTA: Durante este proceso, la puerta se bloquea y el avance de la inicialización puede seguirse en el panel de control. Una luz verde indica que se ha alcanzado la temperatura de -90 °C. Aparecerá una advertencia si se intenta realizar imágenes antes de completar la inicialización.
   2. Asegúrate de que los datos se guarden automáticamente: Haz clic en adquisición Guardado automático y selecciona la carpeta correcta.
   3. Selecciona luminiscencia y fotografía. Comprueba los ajustes de luminiscencia por defecto: Configura el filtro de excitación en Bloque y el filtro de emisión en Abierto.
   4. Ajusta el tiempo de exposición a Auto al tomar la primera imagen, especialmente si esperas una señal tenue, para asegurar un número adecuado de fotones. Para mediciones in vivo y señales brillantes, establece el tiempo de exposición a ~30 s. Si la imagen está saturada, aparecerá una advertencia. Si esto ocurre, reduce el tiempo de exposición.
   5. Selecciona el Binning medio, F/stop 1 y elige el campo de visión (FOV) correcto (D para 5 animales).
   6. Ajusta la altura del sujeto a 1 cm al hacer imágenes de ratones.
   7. Haz clic en Añadir tres veces en el Panel de Control de Adquisición para obtener una secuencia de tres imágenes, a medida que se replica técnicamente.
2. Imagen
   1. Colocar los ratones en la cámara de imagen en posición supina y utilizar el cono nasale del múltiple para mantener la anestesia (isoflurano 1,5%) durante todo el experimento. Imagina hasta 5 ratones simultáneamente y separa los animales usando el deflector de luz para evitar la reflexión.
   2. Cierra la puerta y haz clic en Adquirir para iniciar la secuencia de imagen.
   3. Rellena información detallada sobre el experimento (animales de tipo salvaje y eliminatorio, tratamientos, día de la imagen, etc.). Los ajustes de imagen, como el tiempo de exposición, se guardan automáticamente.
   4. Saca a los ratones de la cámara de imagen y devuélvelos a su jaula. Comprueba la recuperación completa tras la anestesia. En cuestión de minutos, los animales deberían estar completamente despiertos y exploradores. No me des analgesia porque podría interferir con el curso de la infección urinaria.
   5. Devuelve las jaulas a los estantes ventilados hasta el siguiente ciclo de imagen. Tras completar el experimento, se eutanasia a los animales mediante asfixia por CO₂ o dislocación cervical. Haz esto antes de la recuperación de la anestesia de isoflurano para minimizar el malestar

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vaporizador de anestesia	Aparato de Harvard limitado	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacina
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Angiocateter amarillo, usa una punta plástica estéril para la instilación
Ratones C57Bl/6J	Janvier	N/A
Centrífuga 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Laboratorios Desencadenados	Trineo	para medir el diámetro exterior 600nm
Suero tamponado con fosfato de Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanol 70% desnaturalizado 5L	VWR internacional	85825360
Falcon 14 ml tubo de poliestireno con fondo redondo, tapa de presión	Corning	352057
Falcon 50ml Cellstart	Greiner	227285
Jeringuilla Hamilton GASTIGHT, bloqueo de luer de PTFE, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	para asegurar una lenta instillación bacteriana de 50 μL
Bucle de inoculación	Roth	6174.1	poseedora: Art. Nº 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Productos veterinarios Dechra	N/A	Isoflurano
Sistema de Imagen In Vivo del Espectro IVIS	PerkinElmer	REF 124262	Dispositivo de imagen