Preparación de cultivo de Agrobacterium para la entrega de genes en células vegetales

Resumen

Fuente: Shi, J., et al., Cribado e identificación de supresores silenciadores de ARN a partir de efectores secretados de patógenos vegetales. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo muestra el procedimiento para preparar un cultivo de Agrobacterium tumefaciens induciendo la expresión génica de virulencia con acetosiringona, seguida de la eliminación de antibióticos mediante lavado y resuspensión, para generar una suspensión lista para la transformación que permita la entrega génica en los tejidos vegetales.

Protocolo

1. Preparación de cultivo de Agrobacterium para infiltración

1. Elige una colonia positiva de la placa de Luria-Bertani (LB) e inocúla las células en un tubo de vidrio que contiene 5 mL de medio LB suplementado con 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina. Cultiva las células a 30 °C con agitación a 200 rpm durante 24−48 horas.
2. Transfiere 100 μL de cultivo a 5 mL de medio LB suplementado con los mismos antibióticos, 10 mM de ácido etanosulfónico 2-(N-morfolino) (MES; pH 5,6) y 20 μM acetosiringona (AS). Cultiva bacterias a 30 °C con agitación a 200 rpm durante 16−20 horas.
3. Centrifugar las celdas a 4.000 x g durante 10 minutos. Vierte el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 2 mL de buffer de 10 mM MgCl₂ .
4. Repite el paso 1.3 para asegurar la eliminación completa de los antibióticos.
5. Determina la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀). Ajusta a un OD₆₀₀ de 1,5−2,0 con 10 mM de_{MgCl 2} de buffer.
6. Añadir 10 mM de MES (pH 5,6) y 150 μM de AS a los cultivos finales en suspensión e incubar las células en RT durante al menos 3 horas sin agitar.
   NOTA: No dejes las culturas finales de suspensión durante la noche.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 2-morfolinoetanolsulfónico (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
Acetosiringona (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Inducción de Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Bacto Triptona	BD Biociencias	211705	LB medium
Extracción de levadura de bacto	BD Biociencias	212750	LB medium
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	K1914	Antibióticos
Rifampicina	MP Biomedicina	219549005	Antibióticos
Cloruro de sodio	Amresco	0241-10KG	LB medium