Preparación del tejido de vejiga de ratón para la visualización de infecciones bacterianas

Abstract

Fuente: O'Brien, V. P., et. al., Infección urinaria recurrente de Escherichia coli desencadenada por exposición a la vejiga a Gardnerella vaginalis en ratones. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demuestra el uso de microscopía electrónica de barrido para visualizar la colonización bacteriana y las interacciones huésped-patógeno en el epitelio de vejiga de un modelo murino preinfectado.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité local de cuidado institucional de animales y la junta veterinaria JoVE.

1. Obtención de imágenes de las vejigas mediante microscopía electrónica de barrido

   NOTA: Este procedimiento puede realizarse en cualquier momento en el que se desee la visualización del urotelio. Como se indica en la Figura 1 (cajas moradas), las interacciones uropatógenas entre E. coli (UPEC) y uroteliales se visualizan mejor entre 6 h y 24 h tras la inoculación UPEC durante la fase de formación del reservorio, y la exfoliación urotelial provocada por Gardnerella vaginalis se visualiza mejor entre 3 h y 12 h después de la segunda exposición a G. vaginalis .

   1. Fijación in situ de la vejiga
      1. Preparar el fijador inmediatamente antes de la extracción de la vejiga añadiendo glutaraldehído (2,5% final) y paraformaldehído (2% final) en un tampón de cacodilato sódico 0,15 M con 2 mM de_{CaCl 2} a pH 7,4. Utiliza paraformaldehído y glutaraldehído de ampollas de vidrio recién abiertas, ya que ambos fijadores se oxidan con el tiempo en recipientes abiertos. PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico, un irritante respiratorio y corrosivo; El paraformaldehído es inflamable, cancerígeno, un irritante y una toxina reproductiva; El cacodinato sódico es tóxico y cancerígeno.
      2. Para obtener 50 mL de solución fijadora, añade 6,25 mL de paraformaldehído al 16%, 2 mL de glutaraldehído al 50% y 16,75 mL de agua ultrapura a 25 mL de una solución 0,3 M de cacodilato de sodio a pH 7,4 con 4 mM de_{CaCl 2}.
      3. Calienta el fijador preparado a 37 °C antes de administrarlo a las vejigas.
      4. Rellenar la jeringuilla de punta deslizante de tuberculina con fijador y fijar un catéter al extremo, biselado mirando hacia las marcas opuestas de la jeringuilla. Corta el exceso de tubo a 1-2 mm del extremo de la aguja, cuidando de no exponer la punta de la aguja. Haz un toque en la jeringuilla para eliminar las burbujas, empuja el émbolo para evacuar aire y llena el catéter con un fijador sobre un tubo microcentrífuga para recoger cualquier fijador y desecharlo correctamente.
      5. Anestesiar y sacrificar al ratón usando un método aprobado (por ejemplo, luxación cervical bajo anestesia). Coloca el ratón sobre la superficie de disección con las patas aseguradas (con gomas elásticas o alfileres). Abre la zona pélvica del ratón con fórceps y unas tijeras quirúrgicas para exponer la vejiga. Aparta con cuidado la grasa adyacente pero deja la vejiga en su sitio.
      6. Sujeta la jeringuilla con la mano dominante, con la aguja apuntando hacia abajo y las marcas del bisel de la aguja y la jeringuilla mirando hacia otro lado. Sumerja la punta del catéter en lubricante estéril.
      7. Coloca la punta del catéter en la abertura uretral, manteniendo el cañón de la jeringuilla en un ángulo de 30-45° sobre el cuerpo del ratón.
      8. Aplica presión hacia abajo con un movimiento muy pequeño en sentido horario con la punta e inserta suavemente el catéter en la uretra. Cuando la punta del catéter entre en la uretra, gira la jeringuilla hacia la cola del ratón mientras continúas deslizando el catéter más adentro de la uretra hasta que el cilindro de la jeringuilla quede paralelo a la superficie de trabajo. Todo el eje de la aguja del catéter (sin contar la base) debe entrar en el ratón, posicionando la punta del catéter dentro del lumen de la vejiga.
      9. Administra lentamente entre 50 y 80 μL de fijador, haciendo que la vejiga se inflle como un globo. Mantén el catéter en su sitio y levanta ligeramente la jeringuilla, inclinando la punta hacia arriba.
      10. Con la otra mano, abre un hemostático y desliza una punta bajo la aguja del catéter en la intersección de la uretra. Cierra parcialmente el hemostático hasta que toque la aguja.
      11. Desliza suavemente la aguja del catéter fuera de la vejiga mientras al mismo tiempo aprietas y bloqueas completamente el hemostático para evitar la pérdida del fijador.
      12. Sujeta el hemostático de modo que quede paralelo a la superficie de trabajo con la vejiga apoyada encima. Levanta suavemente y corta con cuidado bajo el hemostat (lado opuesto de la vejiga) para retirar la vejiga con el hemostat aún adherido.
      13. Coloca la vejiga y el hemostat en un tubo Falcon que contiene el fijador calentado. Asegúrate de que la vejiga esté completamente sumergida en el líquido y no presionada contra las paredes del tubo. Incubar a 4 °C durante 24 horas.
   2. Procesamiento e imagen de vejiga con microscopía electrónica de barrido (SEM)
      1. Cortar sagitalmente la vejiga por la mitad con una cuchilla de afeitar limpia y de doble cara, y hacer un segundo corte tangencial al hemostato para liberar la vejiga. Esto da lugar a 2 "copas" de media vejiga. Si quedan almohadillas grasas en el exterior de la vejiga, retíralas suavemente.
      2. Enjuaga las mitades de la vejiga tres veces (10 min cada una) en un tampón de cacodilato de sodio (0,15 M, pH 7,4).
      3. Tingue el tejido con tetróxido de osmio al 1% en un tampón cacodilato de 0,15 M durante 1 h a temperatura ambiente. El osmio es sensible a la luz; Por lo tanto, realiza este paso con el recipiente de tinción envuelto en papel de aluminio para mantener un ambiente oscuro. ​
         PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es tóxico y corrosivo para la piel. Haz este paso en la campana extractora con guantes.
      4. Enjuaga las mitades de la vejiga tres veces (10 minutos cada una) con agua ultrapura. Durante estos pasos, a veces se puede ver aceite osmicado en la superficie del agua. Aspira o seca esta para evitar contaminaciones durante los pasos de secado.
      5. Deshidrata los tejidos sumergiéndolos en una serie de etanol graduado (50, 70, 90, 100 y 100%) durante 10 minutos cada uno.
      6. Seca el tejido fijo usando un secador de punto crítico, realizando intercambios de 12 CO₂ a la velocidad más lenta. Pon todos los ajustes adicionales en lento, excepto el paso de ventilación, que está en rápido.
      7. Cortar cada mitad de la vejiga de nuevo con una maquinilla de afeitar limpia de doble cara para generar un total de 4 piezas y así reducir la curvatura de la muestra y lograr un recubrimiento más eficiente, facilitar la obtención de imágenes en el SEM y exponer el tejido que podría haberse enrollado durante el secado.
      8. Adhere las piezas de la vejiga a una pestaña adhesiva de carbono conductora en un muñón de aluminio y pinta una pequeña cantidad de adhesivo plateado alrededor del contacto inferior con un palillo, teniendo cuidado de evitar que el exceso de adhesivo se absorba hacia la superficie interna de la vejiga.
      9. Utiliza un pulverizador de alto vacío para cubrir los muñones de muestra con 6 nm de iridio. Si las muestras continúan cargando, asegúrese de que se pinte un camino conductor hacia la superficie con pintura plateada y cubra con 4 nm adicionales de iridio.
      10. Fotografía las muestras con un microscopio electrónico de barrido. Aunque las condiciones pueden variar según el microscopio utilizado, una tensión de aceleración de 3 KeV con una corriente de haz de 200 pA y una distancia de trabajo de 12-13 mm funcionó bien en un Zeiss Merlin FE-SEM al usar el detector de electrones Everhart-Thornley (SE2).

Results

Figura 1. Esquema del modelo de ratón. La línea temporal se resalta para reflejar las fases o procedimientos del modelo descritos en el protocolo. Fase 1 (naranja): Establecimiento de reservorios intracelulares de E. coli uropatógeno...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 agujas	BD	305106	Para catéteres
Hemostat de pinza recta de 5 1/2"	McKesson	487377	Fijación in situ de la vejiga
Recubridor ACE 600 Sputter	Leica		Procesamiento de muestras SEM
Un muñón de SEM de aluminio	Ted Pella	16111	Procesamiento de muestras SEM
Cloruro de calcio	EMS	12340	Fijación in situ de la vejiga
Pestaña adhesiva de carbono conductor	Ted Pella	16084-1	Procesamiento de muestras SEM
Pintura plateada conductora	Ted Pella	16034	Procesamiento de muestras SEM
Secador de puntos críticos CPD 300	Leica		Procesamiento de muestras SEM
Clip metálico de citoembudo	Simport	M964B	Análisis de orina citospinado
Etanol	EMS	15050	Procesamiento de muestras SEM
Glucosa	Sigma	G7528	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Glutaraldehído	EMS	16320	Fijación in situ de la vejiga
Kit de tinción Hema 3	Fisher	23123869	Análisis de orina citospinado
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Iridio	Ted Pella	91120	Procesamiento de muestras SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Microscopio electrónico de barrido
Purificador de agua Milli-Q	Millipore	IQ-7000	Procesamiento de muestras SEM
Tetróxido de osmio	EMS	19170	Procesamiento de muestras SEM
Paraformaldehído	EMS	15710	Fijación in situ de la vejiga
Tubería de polietileno	Intramédico	427401	para catéteres
Proteosa Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Para NYCIII G. vaginalis medio de crecimiento
Cuchilla de afeitar de doble filo recubierta de PTFE	EMS	72000	Cortar vejigas para el MEB