Aislamiento y cultivo de bacterias a partir de embriones de pez cebra para evaluar la carga de infección

Resumen

Fuente: Bernut, A., et al., Descifrando e Imaginando la patogénesis y el cordón de Mycobacterium abscessus en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demuestra un protocolo para aislar y cuantificar Mycobacterium abscessus de un embrión infectado de pez cebra. El procedimiento implica la eutanasia embrionaria, la lisis tisular y la homogeneización para liberar las bacterias, seguidas de centrifugación y resuspensión en un tampón de tensioactivo. Finalmente, la suspensión bacteriana se diluye en serie, se coloca en un agaro suplementado con antibióticos e incuba para permitir la formación y cuantificación de colonias.

Protocolo

1. Preparación y almacenamiento del inóculo de M. abscessus
   1. Condiciones de crecimiento de M. abscesus
      1. Sacar M. abscesus de un stock de glicerol a -80°C sobre un agar Middlebrook 7H10 que contiene un 10% de OADC y 0,5% de glicerol (7H10OADc), y suplementado con el antibiótico adecuado según el marcador de resistencia que transmita el vector que codifica la proteína fluorescente. Incuba las placas a 30 °C durante 4-5 días.
      2. Recoge una colonia de micobacterias fluorescente-positiva e inocula 1 ml de caldo Middlebrook 7H9 suplementado con OADC, 0,2% glicerol y 0,05% Tween 80 (7H9OADc/T) con el antibiótico necesario en un tubo plástico estéril de 15 ml. Incubar a 30 °C durante una semana sin temblar.
         NOTA: Tween 80 limita la formación de aglomeraciones y la agregación bacteriana.
      3. Resuspender el precultivo obtenido en 2.1.2 en 50 ml de Middlebrook 7H9OADc/T en matrazas de cultivo tisular de 150 cm2 hasta un diámetro de campo_{final de 0,1 de 600} (correspondiente a unos 5,107 bacterias/ml) y incubar a 30 °C durante 4 días para obtener un cultivo de crecimiento exponencial (_{DE 600} = 0,6 a 0,8).
         NOTA: Para minimizar los aglomerados, especialmente de la variante áspera, la incubación no debe exceder los 5 días. Tanto las variantes suaves como las rugosas muestran una tasa de crecimiento similar.
2. Preparación del M. abscessus inocula
   NOTA: Debido a la alta propensión del absceso rugoso de M . a formar grandes agregados y a producir cordones, es necesario un tratamiento específico para generar unóculos homogéneos y controlados cuantitativamente antes de las microinyecciones en los embriones. Este tratamiento también se aplica a bacterias lisas que producen agregados, aunque en menor medida que la cepa rugosa.
   1. Cosechar cultivos de crecimiento exponencial de matraces de cultivo de tejido de 150 cm2 mediante centrifugación a 4.000 x g durante 15 minutos en tratamiento en un tubo plástico estéril de 50 ml y resuspender el pellet bacteriano en 1 ml 7H9OADc/T. Alocar 200 μl de suspensiones bacterianas en tubos microcentrífugas de 1,5 ml.
      NOTA: Es necesario trabajar con pequeños volúmenes en jeringuillas de 1 ml para obtener suspensiones altamente homogéneas.
   2. Homogeneizar las suspensiones bacterianas con una aguja de 26 G (15 secuencias de subidas y bajas), sonicar tres veces durante 10 segundos (con pausas de 10 segundos entre cada secuencia de sonicación) usando un sonicador de baño de agua. Añade 1 ml de 7H9OADc/T y haz un vórtice breve. Centrifugar 3 minutos a 100 x g.
   3. Recoge cuidadosamente los sobrenacionantes que contienen micobacterias para evitar los grumos y agrupa las suspensiones homogéneas en un tubo plástico estéril de 50 ml.
   4. Comprobar visualmente la presencia de agregados bacterianos restantes eventualmente.
      NOTA: Si aún hay agregados, se procede a un paso adicional de centrifugación a 100 x g durante 2 minutos y se recoge el sobrenadante.
   5. Centrifugar la suspensión a 4.000 x g durante 5 minutos, volver a suspender el pellet en 200 μl 7H9OADc/T y proceder a la inyección.
   6. Evalúa la concentración bacteriana final mediante placas de diluciones seriadas (en 1x PBST) en agar 7H10OADc y contando unidades formadoras de colonias (UFC) tras 4 días de incubación a 30 °C. Se deben determinar UFC para cada nuevo lote.
   7. Prepara los stocks de inocula congelados almacenando alicotas de 5 μl a -80 °C.
      NOTA: La evaluación de la CFU de las alicotas congeladas a -80°C es un requisito previo para determinar el número exacto de bacterias viables, ya que la congelación o descongelación puede afectar la viabilidad bacteriana del inóculo. Estos inóculos congelados están listos para usarse en inyecciones posteriores. Dado que todas las alicuotas contienen el mismo número de UFC, permiten inyectar bacterias de forma reproducible de un experimento a otro.
3. Control de calidad del inóculo
   NOTA: La tinción Ziehl-Neelsen (específica para micobacterias) puede utilizarse para comparar la calidad de las suspensiones bacterianas antes y después de los procedimientos de homogeneización.
   1. Localiza y extiende una gota de la suspensión bacteriana homogeneizada sobre una lámina de vidrio y deja que se seque completamente. Fija la mancha durante al menos 30 minutos en una placa caliente ajustada a 65-70 °C y tiñe usando un protocolo de tinción Ziehl-Neelsen.
   2. Observa la citología bacteriana con un microscopio usando un objetivo 100X y compárala con una extensión de una suspensión bacteriana no procesada (Figura 1).

2. Preparación de embriones de pez cebra

1. Desove y recolección de huevos de pez cebra
   1. El día antes de la desova, cría peces cebra adultos colocando 2 machos y 1 hembra (normalmente una proporción de 2:1 permite la tasa óptima de fertilización) en una cámara de cría, que consiste en un acuario separado con una cesta de recogida de huevos.
      NOTA: Las cestas de recogida de huevos se utilizan para proteger los huevos de que los padres los coman y facilitar la cosecha de huevos.
   2. A 1 hpf, cosechar huevos y solo embriones bien desarrollados en una placa de Petri de 100 mm llena con 25 ml de agua azul para peces (máximo 100 embriones por plato) y mantenerlos a 28,5 °C. Los huevos no fertilizados se descartan.
2. Preparación de embriones de pez cebra para inyecciones
   1. Alrededor de las 24 horas después de la fecundación (hpf), descoriiona los embriones con pinzas finas en una placa de Petri de 100 mm y mantenlos a 28,5 °C.
   2. Recoge los 30-48 embriones de hpf usando una pipeta y transfiere a una cámara de posicionamiento en forma de "V" llena con 25 ml de agua de pescado que contiene 270 mg/L de tricaína. Coloca los embriones correctamente en los canales usando una herramienta casera de punta microcargadora (una punta casera cliptada) optimizada para una micromanipulación más sencilla.
      NOTA: Orientar el lado dorsal hacia abajo para las inyecciones intravenosas en la vena caudal o el lado dorsal hacia arriba para las inyecciones del músculo colal.

3. Procedimiento de microinyección

NOTA: Para evaluar la cronología de la infección por M. abscesus (supervivencia, cargas bacterianas, cinética y características de la infección), se prefieren inyecciones en la vena caudal de 30 embriones de HPF. Para visualizar el reclutamiento de células inmunitarias, se realizan inyecciones en sitios localizados, como en los músculos caudales de un embrión de 48 hpf.

1. Diluir el inóculo micobacteriano en 1X PBST (dependiendo del número de UFC que se administre), que contenga un 10% de fenol rojo para comprobar la inyección adecuada.
2. Carga una aguja microcapilar con 5-10 μl del inóculo bacteriano usando una punta microcargadora, conecta la aguja de microinyección al soporte del micromanipulador tridimensional conectado al inyector y rompe la parte superior de la aguja con pinzas finas para obtener un diámetro de apertura de 5-10 μm.
3. Calibra el volumen de inyección ajustando la presión de microinyección (20-50 hPa) y el tiempo (0,2 seg).
   NOTA: El volumen de inyección requerido se calibra mediante la determinación visual del diámetro de una gota expulsada en la yema de un embrión.
4. Para la inyección en la vena caudal, coloca el embrión con el lado ventral mirando hacia la aguja y coloca la punta de la aguja cerca de la abertura urogenital, dirigiéndote a la vena caudal, y empuja suavemente la punta de la aguja dentro del embrión hasta que apenas perfore la región de la vena caudal. Administra el volumen deseado de preparación bacteriana, normalmente de 1 a 3 nl que contenga alrededor de 100 UFC/nl.
5. Para la inyección intramuscular, coloca el embrión con el lado dorsal mirando hacia la aguja, coloca la aguja sobre un somite e inyecta un pequeño volumen (1 nl) de inóculo.
   NOTA: En cuanto a las inyecciones en la vena caudal, las inyecciones intramusculares también son difíciles de realizar. Hay que tener cuidado para evitar sobrecargas, que podrían dañar los tejidos circundantes.
6. Al final del procedimiento de inyección, controla el tamaño del inóculo inyectando el mismo volumen de suspensión bacteriana en una gota de PBST estéril, seguido de la placificación en 7H10OADc y contando la UFC. Se pueden inyectar alrededor de 100 embriones con una aguja.
   NOTA: Dado que el absceso rugoso de M . puede seguir formando agregados en la aguja, las inyecciones deben realizarse inmediatamente después de la preparación del inóculo.
7. Transfiere individualmente a los peces infectados a placas de 24 pozos que contienen 2 ml/pozo de agua para peces e incuba a 28,5 °C. Se pueden usar embriones inyectados con 1-3 nl 1X PBS como controles.
8. La infección adecuada de bacterias fluorescentes en embriones se monitoriza utilizando un microscopio de fluorescencia.

4. Cuantificación de la carga bacteriana

1. Determinación mediante enumeración de UFC
   1. En el momento deseado, recoger grupos de embriones infectados (5 por condición) en tubos microcentrífugas de 1,5 ml (1 embrión/tubo), crioanestesiar los embriones incubándolos en hielo durante 10 minutos y eutanasiar con una sobredosis de tricaína (300-500 mg/L)
   2. Lava los embriones con agua estéril dos veces y dispensa en un tubo nuevo. Lisa cada embrión con Triton X-100 al 2% diluido en 1X PBST usando una aguja de 26-G y homogeneiza la suspensión hasta la lisis completa. Centrifuga la suspensión y vuelve a suspender el pellet en 1X PBST con 0,05% Tween 80. Las diluciones en serie de los homogeneados se emplatan en Middlebrook 7H10OADc y se complementan con BBL MGIT PANTA, según lo recomendado por el proveedor.
      NOTA: M. abscesus es más susceptible al tratamiento con NaOH que M. marinum. La descontaminación de lisados de peces sin afectar el crecimiento de M. absceso puede lograrse con éxito utilizando el cóctel de antibióticos BBL MGIT PANTA.
   3. Incubar las placas durante 4 días a 30 °C y contar las colonias.

Resultados

Figura 1. Preparación del inóculo disperso de M. abscessus.Tinción Ziehl-Neelsen de variantes R o S cultivadas en medio de caldo antes de cualquier tratamiento (paneles superiores) o después del tratamiento (pane...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BBL MGIT PANTA	BD Biociencias	245114
Albúmina sérica bovina	Euromedex	04-100-811-E
Catalasa de hígado bovino	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biociencias	262710
Caldo Difco Middlebrook 7H9	BD Biociencias	271310
Sal de metanosulfonato de etil 3-aminobenzoato (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Ácido oleico	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehído	Microscopia Delta	15710
Rojo fenólico	Sigma-Aldrich	319244
Preadolescentes 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Agarosa de baja fusión	Sigma-Aldrich
Sales marinas oceánicas instantáneas	Sistemas de Acuarios Inc
Capilares de vidrio borosilicato	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm de diámetro exterior x 0,78 mm de identificación
Dispositivo de micropipeta	Sutter Instrument Inc		Extractor de micropipetas de llama/marrón p-87
Microinyector	Investigación Tritech		MicroINYECTOR digital, MINJ-D
Pinzas	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Puntas para microcargadores	Eppendorf