Modelado de la patogénesis de Aeromonas en C. elegans mediante un ensayo de supervivencia

Resumen

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo muestra un ensayo de supervivencia utilizando C. elegans para modelar la patogénesis de Aeromonas , donde la ingestión oral de la bacteria provoca infección intestinal y mortalidad, permitiendo una evaluación cuantitativa de la virulencia bacteriana en un sistema huésped vivo.

Protocolo

1. Ensayo de supervivencia de C. elegans con Aeromonas

1. El día de la siembra de gusanos L1 en el ENGM (medio de crecimiento nematodo enriquecido) que se estén extendiendo con E. coli OP50, se selecciona una sola colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o E. coli OP50 y cultiva con caldo de 2 mL LB, respectivamente, a 37 °C durante 16 horas.
   NOTA: Para evitar la contaminación, este paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Aquí se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: E. coli OP50, la fuente normal de alimento de C. elegans. A. dhakensis AAK1, el primer aislado clínico patógeno completamente secuenciado de A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 y A. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativos del Hospital Nacional de la Universidad Cheng Kung.
2. Mide la absorbancia de₆₀₀ (densidad óptica a 600 nm) del caldo bacteriano y ajusta el caldo a₆₀₀ = 2,0 con LB de caldo.
3. Localiza y extiende 30 μL de caldo bacteriano en cada placa de 6 cm de NMN (medio de crecimiento para nematodos). Cultiva las placas a temperatura ambiente durante la noche.
   NOTA: Para preparar NGM, disuelva 3 g de NaCl (cloruro de sodio), 2,5 g de peptona bacteriana y 20 g de agar en 1 litro de agua desionizada. Autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Espera hasta que se enfríe a 55 °C en baño maria y luego añade 1 mL de 1 M_{CaCl 2} (cloruro de calcio), 1 mL de 1 M_{MgSO 4} (sulfato de magnesio), 1 mL de colesterol al 5% en etanol y 25 mL de tampón de fosfato. Haz un giro para mezclar bien.
4. El día que los gusanos L1 crecen hasta la etapa L4, selecciona y transfiere aleatoriamente 50 gusanos a una placa NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o E. coli OP50.
5. Incubar las placas NGM a 20 °C hasta que termine el ensayo.
6. Transfiere todos los gusanos vivos a una placa NGM recién preparada con bacterias y cuenta el número de gusanos vivos, muertos y sensores cada día hasta que el último gusano muera.
   NOTA: Transfiere los gusanos a una placa NGM recién preparada cada día para el mantenimiento de la infección, incluso usando gusanos estériles (por ejemplo, glp-4 o con FudR).
7. Grafica las curvas de supervivencia basándote en el cálculo diario de los datos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubación bacteriana
NaCl	SIGMA	31434	Preparación del medio de cultivo
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparación del medio de cultivo
Agar	Difco	214530	Preparación del medio de cultivo
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparación del medio de cultivo
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparación del medio de cultivo
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparación de placas de agar
Peptona bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparación del medio de cultivo
FudR	SIGMA	1271008	Preparación del medio de cultivo
Sistema de microscopio	Nikon	Eclipasa Ti invertida	Imagen microscopica