Evaluación de la virulencia bacteriana utilizando el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans

Abstract

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo muestra el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas, un método utilizado para evaluar la virulencia bacteriana midiendo la supervivencia de gusanos en un entorno líquido con pocos nutrientes. El ensayo revela patogenicidad específica de la cepa basada en la extensión del daño y mortalidad inducidos por toxinas en C. elegans.

Protocol

1. Ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas

NOTA: Para evitar la contaminación, se deben realizar pasos en una campana de flujo laminar.

1. Al día siguiente de sembrar los gusanos L1 en la placa ENGM (medio de crecimiento nematodo enriquecido) se extienden con E. coli OP50, se recoge una sola colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y E. coli OP50, y se cultiva con caldo de 5 mL LB cada uno a 37 °C durante 16 horas.
   NOTA: En el protocolo, se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: E. coli OP50, la fuente normal de alimento de C. elegans. A. dhakensis AAK1, el primer aislado clínico patógeno completamente secuenciado de A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 y A. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativos del Hospital Nacional de la Universidad Cheng Kung.  
   NOTA: Para preparar NGM enriquecido (ENGM), disuelva 3 g de NaCl, 5 g de peptona bacteriana, 1 g de extracto de levadura y 30 g de agar en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Espera hasta que se enfríe a 55 °C en baño maria y añade 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de 1 M_{MgSO 4}, 1 mL de colesterol al 5% en etanol y 25 mL de tampón de fosfato. Haz un giro para mezclar bien.
2. Mide la absorción OD₆₀₀ del caldo de bacterias.
3. Centrifuga el caldo bacteriano a 3.500 x g durante 15 minutos para eliminar el caldo LB. Resuspende las bacterias y ajusta el caldo bacteriano a un OD₆₀₀ = 3.0 con medio S. Añade 195 μL de caldo bacteriano en medio S a al menos 8 pozos de una placa de 96 pozos.
   NOTA: La composición del medio S: Para preparar el medio S, mezcle 40 mL de basal S, 0,4 mL de citrato de potasio M, 0,4 mL de solución de metales traza, 0,12 mL de 1 M_{CaCl 2}, 0,12 mL de 1 M MgSO₄, 40 μL de colesterol al 5% en etanol y 1 mL de 8 mM FudR antes de su uso.
4. Lava los gusanos L4 de la placa ENGM con E. coli OP5 usando medio M9. Ajustar la solución de gusano a una concentración de 5 gusanos por μL y añadir 5 μL de la solución de gusano a cada pozo de la placa de 96 pozos. Asegúrate de que haya aproximadamente 25 lombrices por pozo.
5. Incuba la placa de 96 pozos en un agitador a 200 rpm a 25 °C.
6. Cuenta el número de gusanos vivos y muertos después de 24, 48 y 72 horas. Calcula las tasas de supervivencia de cada pozo con la siguiente fórmula: (Gusanos vivos/Total de gusanos) × 100%.
7. Dibuja un gráfico de dispersión con el cálculo diario de datos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubación bacteriana
NaCl	SIGMA	31434	Preparación del medio de cultivo
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparación del medio de cultivo
Agar	Difco	214530	Preparación del medio de cultivo
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparación del medio de cultivo
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparación del medio de cultivo
Etanol	SIGMA	32205	Preparación del medio de cultivo
KOH	SIGMA	P5958	Preparación del medio de cultivo
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparación de placas de agar
Placa de 96 pozos	FALCON	353072	Ensayo líquido
Peptona bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparación del medio de cultivo
Extracto de levadura	SIGMA	92144	Preparación del medio de cultivo
Ácido cítrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparación del medio de cultivo
Tri-citrato de potasio•H₂O	SIGMA	104956	Preparación del medio de cultivo
FudR	SIGMA	1271008	Preparación del medio de cultivo
EDTA disódico	SIGMA	E1644	Preparación del medio de cultivo
Triptona	SIGMA	16922	Preparación del medio de cultivo
Sistema de microscopio	Nikon	Eclipasa Ti invertida	Imagen por microscopio
Cámara CCD Científica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagen por microscopio