Ensayo de necrosis muscular en C. elegans inducido por una cepa patógena de Aeromonas

Resumen

Fuente: Chen, Y. et al., Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo muestra un ensayo de necrosis muscular en C. elegans (Caenorhabditis elegans) utilizando cepas patógenas de Aeromonas . Al alimentar con gusanos que expresan proteína fluorescente verde (GFP) en placas con semillas de Aeromonas, el ensayo modela la infección bacteriana y revela daños tisulares mediante imágenes de fluorescencia. La pérdida progresiva de la estructura muscular y la señal de GFP indica una respuesta necrótica inducida por Aeromonas.

Protocolo

1. Ensayo de necrosis muscular de Caenorhabditis elegans con Aeromonas

NOTA: Para evitar contaminaciones, estos pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar.

1. El día en que se siembran los gusanos L1 en el medio de crecimiento nematodo enriquecido (ENGM) distribuido con Escherichia coli OP50, selecciona una sola colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y E. coli OP50 y cultiva con 2 mL de caldo Luria-Bertani (LB) cada una a 37 °C durante 16 h. NOTA: Aquí se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: E. coli OP50, la fuente normal de alimento de C. elegans. A. dhakensis AAK1, el primer aislado clínico patógeno de A. dhakensis completamente secuenciado. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 y A. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativos del Hospital Nacional de la Universidad Cheng Kung.
2. Mide la absorbancia_{de 600} de diámetro de carbono del caldo de bacterias y ajusta el caldo de bacterias a_{600 de diámetro de 600} = 2,0 con LB de caldo. Localizar y esparcir 30 μL de caldo bacteriano sobre placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) de 6 cm. Cultiva las placas a temperatura ambiente durante la noche.
3. El día en que los gusanos L1 crezcan hasta la etapa L4, transfiere 50 gusanos a cada placa NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o E. coli OP50. Incubar las placas NGM a 20 °C. Transfiere los gusanos cada 24 horas a placas NGM recién preparadas con bacterias.
4. Toma imágenes musculares con un microscopio de fluorescencia.
   1. Selecciona al azar 10 gusanos sobre un gel de agarosa al 2% en medio M9 en una lámina. Paraliza los gusanos usando 2 μL de azida sódica al 1% en medio M9 sobre agarosa durante menos de 5 minutos antes de tomar imágenes.
   2. Coloca una cubierta y captura las imágenes musculares usando un filtro de proteína fluorescente verde (GFP) en un microscopio fluorescente con cámara de dispositivo acoplado de carga. Captura las imágenes musculares a las 24, 48 y 72 horas después de la etapa L4.

Realiza análisis de imágenes y preparación de figuras con un software de procesamiento de imágenes.
NOTA: Las definiciones de las puntuaciones y los niveles de daño muscular se muestran en la Figura 1, para la cual los criterios se enumeran de la siguiente manera: 3 puntos por la ausencia de fibras musculares; 2 puntos por fibras musculares rotas o rotas; 1 punto por fibras musculares dobladas; 0 puntos por fibras musculares saludables.

Resultados

Figura 1: Las puntuaciones correspondientes para necrosis muscular en C. elegans inducida por infección por Aeromonas. Los criterios para la necrosis muscular y las puntu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubación bacteriana
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Preparación del medio de cultivo
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Preparación del medio de cultivo
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Preparación del medio de cultivo
NaCl	SIGMA	31434	Preparación del medio de cultivo
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparación del medio de cultivo
Agar	Difco	214530	Preparación del medio de cultivo
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparación del medio de cultivo
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparación del medio de cultivo
Etanol	SIGMA	32205	Preparación del medio de cultivo
KOH	SIGMA	P5958	Preparación del medio de cultivo
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparación de placas de agar
Peptona bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparación del medio de cultivo
Extracto de levadura	SIGMA	92144	Preparación del medio de cultivo
Ácido cítrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparación del medio de cultivo
Tri-citrato de potasio•H₂O	SIGMA	104956	Preparación del medio de cultivo
FudR	SIGMA	1271008	Preparación del medio de cultivo
EDTA disódico	SIGMA	E1644	Preparación del medio de cultivo
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Preparación del medio de cultivo
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Preparación del medio de cultivo
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Preparación del medio de cultivo
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Preparación del medio de cultivo
Triptona	SIGMA	16922	Preparación del medio de cultivo
Sistema de microscopio	Nikon	Eclipasa Ti invertida	Imagen microscopica
Cámara CCD Científica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imagen microscopica