Estabilización mediada por fibra de curli de patrones de hidrogel bacteriano

Resumen

Fuente: Spiesz, E. M., et al., Patrón tridimensional de biopelículas ingenierizadas con un bioimpresor bricolaje. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra un método para comparar patrones de alginato impresos en 3D que contienen cepas bacterianas de control o genéticamente modificadas. La cepa de prueba produce fibras de rizo al inducirlas, que refuerzan la estructura de hidrogel de alginato. Tras el tratamiento con una solución quelante de calcio, solo el patrón de prueba permanece intacto, lo que destaca el efecto estabilizador de la producción de fibras de rizos.

Protocolo

1. 3D Proceso de impresión

1. Instala y abre el software de impresión 3D (Table of Materials) en un ordenador. Conecta la impresora 3D al ordenador. Mueve el cabezal de impresión a su posición principal haciendo clic en el botón de inicio para los ejes X, Y y Z.
2. Para cada impresión, coloca un sustrato de impresión preparado en una ubicación concreta de la cama de impresión.
3. Calibra la altura del cabezal de impresión en el eje Z.
   1. Eleva el cabezal de impresión a una altura de 22 mm bajo control manual, para que no choque con el borde de la placa de Petri al moverte a la posición deseada. Coloca el cabezal de impresión sobre la placa y muévelo hacia abajo hasta que la punta de la pipeta toque la superficie de impresión. Asigna esta posición del eje Z como Z1 (la altura de la superficie de impresión).
   2. Levanta el cabezal de impresión y muévelo fuera del área de la placa mediante control manual en los ejes X, Y y Z. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa está definida como Z2, introduzca Z1 + Z2 en el programa de impresión como el valor Z durante la impresión.
4. Programar la forma de impresión mediante un método autodesarrollado punto por punto y determinado por coordenadas según la trayectoria deseada.
   1. Si la trayectoria deseada es una línea recta, define solo los puntos de inicio y final. Incluir puntos adicionales en líneas curvas resultará en curvas más suaves. Mueve manualmente el cabezal de impresión a cada punto de forma secuencial y registra las coordenadas de estos puntos en orden. Introduce todas estas coordenadas, así como la velocidad de movimiento del cabezal de impresión para cada segmento impreso en el editor de código G.
5. Tanto antes como después de imprimir, levanta el cabezal de impresión a una distancia superior al borde de la placa (20 mm) y muévete directamente fuera de la región de la placa. Guarda este programa como un archivo G-code y carga directamente para usarlo en impresiones posteriores, mientras vuelves a medir la altura del eje Z para cada nuevo sustrato de impresión.
   NOTA: Véase la Tabla 1 para un ejemplo de código G para imprimir un cuadrado.
6. Carga el archivo G-code preprogramado. Abre el editor de código G en el software y programa los comandos para imprimir la forma deseada. En cada línea de comandos, la posición del cabezal de impresión puede cambiarse en los ejes X, Y y/o Z. Introduce el valor Z durante todos los pasos de impresión como Z1 + Z2 (altura de la superficie de impresión + distancia de trabajo).
   NOTA: La velocidad de movimiento también es ajustable; 9.000 mm/min es un valor adecuado para las velocidades de impresión típicas.
7. Carga la bio-tinta líquida en una o varias jeringuillas, y móntalas en la(s) bomba(s) de jeringuilla(s) de la bioimpresora 3D.
8. Imprime la biotinta sobre el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir.
9. Durante la impresión, controla completamente el movimiento del cabezal de impresión mediante el software. Arranca manualmente la bomba de jeringuilla antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie de impresión.
   NOTA: La coordinación entre la bomba de jeringuilla y la impresora se determina empíricamente en función de la velocidad de extrusión, la velocidad a la que el cabezal de impresión se desplaza hasta el primer punto de impresión y la posición inicial del cabezal. Si la posición inicial del cabezal de impresión es de 20 mm, con una velocidad de 9.000 mm/min y una velocidad de extrusión de 0,1 mL/h, arranca la bomba de jeringuilla inmediatamente después de iniciar la impresión. Si la velocidad de extrusión cambia de 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, espere 2−3 s para iniciar la bomba de jeringuilla tras iniciar la impresión.
10. Detener la bomba de jeringuilla tan pronto como el cabezal de impresión llegue al último punto de impresión. Detiene la bomba de jeringuilla antes de que la cabeza de impresión se levante al final del proceso de impresión, de lo contrario el exceso de tinta biológica caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión.
11. Para la construcción de estructuras 3D, controla todos los movimientos del cabezal de impresión en el editor de código G. Escribe la altura de impresión de la primera capa. Aumenta el valor Z en el código G en 0,2 milímetros para la segunda capa y así aumentar la altura de impresión. A partir de entonces, aumenta el valor Z en 0,1 milímetros al pasar a una capa superior. No muevas la plancha durante el proceso de impresión.
12. Para medir el ancho y la altura del hidrogel impreso, utiliza una regla de acero colocada debajo o junto a la muestra.

2. Cultivo y prueba de la eficacia de la producción de biofilm por E. coli

1. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante 3 a 6 días para permitir la producción de componentes de biofilm (fibras de rizos). Haz imágenes de las placas usando una cámara o un escáner fluorescente.
2. Para disolver la matriz de alginato, añade 20 mL de solución de citrato de sodio 0,5 M (pH = 7 ajustado con NaOH) a los sustratos de impresión e incuba durante 2 horas con agitación a 30 rpm a temperatura ambiente. Desecha el líquido y vuelve a fotografiar las placas para compararlas con las imágenes de las placas antes del tratamiento con citrato.

Tabla 1: Proceso de programación y explicaciones del código G para imprimir un cuadrado.

Comandos G-code	Tareas
G1 Z20 F9000	Eleva el eje Z a una altura de 20 mm con una velocidad de movimiento de 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Muévete al punto de inicio de la primera línea con una velocidad de movimiento de 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Muévete hacia abajo en la dirección Z hasta una distancia de impresión propia (aquí Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300	Punto final de la primera línea y punto de inicio de la segunda línea.
G1 X135 Y105	Punto final de la segunda línea y punto de inicio de la tercera línea.
G1 X135 Y65	Punto final de la tercera línea y punto de inicio de la cuarta línea.
G1 X95 Y65	Punto final de la cuarta línea y punto de inicio de la primera línea; se forma un cuadrado.
G1 Z20 F9000	Eleva el eje Z a una altura de 20 mm a 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Muévete a una coordenada (55, 40) fuera del rango de la placa de Petri.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polvo de caldo LB	Sigma-Aldrich	L3022
Agitador orbital	VWR	89032-092	Modelo 3500
Placa de Petri	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Tubería de silicio	VWR	DENE 3100103/25
Bomba de jeringuilla	ProSense B.V.	NE-300
Alginato de sodio	Sigma-Aldrich	W201502
Citrato de sodio monobásico	Sigma-Aldrich	71498
Hidróxido de sodio	VWR	28244.295