Investigación de la actividad microbiana intestinal humana en exopolisacáridos

Resumen

Fuente: Hu, Y. et.al., Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación en baños in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demuestra el análisis de la producción de ácidos grasos de cadena corta por la microbiota intestinal humana en respuesta a exopolisacáridos. Esto pone de relieve la separación y cuantificación de los productos de fermentación microbiana mediante cromatografía de gases. Los resultados revelan que los exopolisacáridos modulan metabolitos microbianos que influyen en la dinámica huésped-patógeno en el intestino.

Protocolo

1. Efectos del exopolisacárido (EPS) en la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) por la microbiota intestinal humana
   1. Añade sobrenadantes fermentados (1 mL) preparados en el paso 5,3 a tubos de centrífuga de 2 mL.
   2. Añade 0,2 mL de ácido metafosfórico al 25% (p/v) a cada una de las muestras y mezcla bien las soluciones mediante vórtice.
   3. Centrifuga las mezclas a 13.000 x g durante 20 minutos y transfiere los sobrenacionantes a tubos nuevos.
   4. Simultáneamente, preparar soluciones de 120 mM de ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico. Luego, añade 1 mL de cada ácido preparado a 1,2 mL de ácido metafosfórico al 25% (p/v) y úsalo como cócteles estándar.
   5. Filtra las muestras usando una membrana de 0,22 μM.
   6. Detectar concentraciones de SCFA mediante cromatografía de gases de alto desempeño.
      NOTA: Se utiliza una columna FFAP InertCap (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) para cromatografía de gases (GC). Las concentraciones de SCFA se cuantifican en función de las áreas de pico utilizando el método estándar interno de punto único en el paquete de software GC Solution.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtros de membrana de 0,22 μm	Millipore	SLGP033RB	Uso para filtrar muestras
Tamiz de 0,4 mm	Thermo Fischer	308080-99-1	Uso para preparar muestras de heces humanas
Acético	Sigma-Aldrich	71251	Ejemplo estándar para SCFA
Butyrico	Sigma-Aldrich	19215	Ejemplo estándar para SCFA
Columna capilar	SHIMADZU-GL	FFAP InertCap (0,25 mm × 30 m × 0,25 μm)	Acostumbrado a la detección SCFA
Cromatografía de gases	Corporación Shimadzu	GC-2010 Plus	Acostumbrado a la detección SCFA
Isobutírico	Sigma-Aldrich	46935-U	Ejemplo estándar para SCFA
Ácidos isovaléricos	Sigma-Aldrich	129542	Ejemplo estándar para SCFA
Ácido metafosfórico	Sigma-Aldrich	B7350	Ejemplo estándar para SCFA
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Solución básica utilizada para ajustar el pH de los tampones
Propiónico	Sigma-Aldrich	94425	Ejemplo estándar para SCFA
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Ejemplo estándar para SCFA