1. Montaje de microscopio y adquisición en lapso de tiempo
NOTA: El protocolo descrito aquí fue desarrollado para un microscopio de campo amplio invertido con autoenfoque, un objetivo PH3 de aceite de 100X/1,30 NA, una etapa motorizada X, Y, una cámara sCMOS, una fuente de luz, filtros para proteínas fluorescentes verdes, fluorescentes rojas o fluorescentes amarillas, y una cámara de incubación controlada por temperatura. Esta cámara mantiene las células protegidas de la luz y a una temperatura constante.
- Precalienta la cámara de incubación y el microscopio a 32 °C durante ~1 - 2 horas antes de comenzar la microscopía.
NOTA: Dependiendo del microscopio, el calentamiento puede tardar más. El precalentamiento es esencial para reducir la deriva y estabiliza el sistema de control de enfoque automático. - Enciende el microscopio y inicia el software de control del microscopio. Selecciona el objetivo correcto y los espejos y filtros adecuados para adquirir imágenes de contraste de fase, así como imágenes de proteínas fluorescentes verdes, fluorescentes rojas o fluorescentes amarillas.
NOTA: Un microscopio suele estar equipado con un software preferido para el control y adquisición de imágenes. Aquí, se utilizó un software comercialmente disponible (véase la Tabla de Materiales) para controlar el microscopio y la adquisición de imágenes. - Añadir una gota de aceite de inmersión de alta calidad al objetivo y al fondo de la muestra, preincubada a 32 °C. Coloca el objetivo en la posición Z más baja posible para evitar dañarlo cuando la muestra se coloque en el escenario del microscopio. Coloca el marco metálico con la muestra sobre el escenario del microscopio, con el "lado del agujero" hacia el objetivo. Sujeta la muestra firmemente en el soporte del escenario.
- Concéntrate en las células moviendo la etapa en la dirección Z más cerca del objetivo. Mueve el escenario despacio cuando el aceite gotee en la parte inferior de la muestra y la lente objetivo haga contacto. Mueve la etapa en la dirección X/Y hasta que varias celdas individuales sean visibles en la región de visión, cuando las celdas están en el plano focal. Asegúrate de que al menos una microsfera fluorescente esté en la región de visión para poder alinear posteriormente las imágenes adquiridas.
NOTA: En condiciones óptimas, se debe alcanzar una densidad de celda de 15 a 30 celdas por región de visión (2.048 x 2.048 píxeles o 133,1 x 133,1 μm). - Abre el asistente de Adquisición Multidimensional del software de control del microscopio para configurar un experimento en lapso de tiempo que permita al microscopio adquirir imágenes en múltiples longitudes de onda y posiciones de escenario si es necesario.
- En la pestaña principal, activa Timelapse y Múltiples Longitudes de Onda. Aparecerán pestañas adicionales en el lado izquierdo de la ventana.
- Haz clic en la pestaña Guardar y selecciona Directorio para seleccionar una carpeta vacía en el disco duro del ordenador y guardar las imágenes adquiridas. Activa el nombre base de Incremento si existe un archivo para asegurarte de que conjuntos de datos consecutivos no sobrescriban los anteriores. Luego asigna al experimento un nombre con fecha y el nombre o título de la cepa del experimento.
- Haz clic en la pestaña Time-lapse para ajustar los parámetros del time-lapse. Pon la duración en 24 horas y el intervalo de tiempo en 20 minutos. El número de puntos de tiempo cambiará automáticamente.
NOTA: El intervalo de tiempo óptimo depende del experimento y de la función celular a analizar. Las adquisiciones frecuentes de imágenes pueden causar fotoblanqueamiento. Por tanto, debe encontrarse empíricamente un equilibrio entre resolución temporal y fotoblanqueo. Con un tiempo de duplicación de 4 - 6 horas, las imágenes pueden adquirirse fácilmente con intervalos de 5 minutos (o incluso en intervalos menores si se desea) para microscopía de contraste de fase. Si se desea una microscopía de fluorescencia a lo largo de un periodo de 24 horas, las imágenes deben registrarse en un intervalo de aproximadamente 15 a 30 minutos. - Haz clic en la pestaña de Longitudes de Onda . Selecciona el número de longitudes de onda que quieres adquirir para cada imagen en cada momento cambiando el número.
NOTA: Para cada longitud de onda, aparecerá una nueva pestaña en el lado izquierdo del asistente de Adquisición Multidimensional y se adquirirán longitudes de onda en el orden de arriba a abajo. Para cada longitud de onda, los ajustes de adquisición pueden modificarse por separado. - Haz clic en la primera pestaña de longitud de onda desde arriba. Selecciona Contraste de fase en la lista desplegable de Iluminación . Selecciona 100 ms para Exposición y selecciona Cada Momento en la lista desplegable Adquirir . Desactiva la Exposición Automática seleccionando Nunca en la lista desplegable.
- Repite el paso 3.5.5 para cada longitud de onda que necesite adquirirse en cada punto temporal. Para el montaje experimental y las proteínas marcadas fluorescentemente descritas aquí, utilice los siguientes parámetros para la Exposición: 250 ms para proteínas de fusión mCherry, 200 ms para proteínas de fusión YFP (proteína fluorescente amarilla) y 1.000 ms para proteínas de fusión GFP (proteína fluorescente verde).
NOTA: Los ajustes óptimos de iluminación para cada cepa y proteína fluorescente deben determinarse de antemano cambiando la intensidad de la lámpara y el tiempo de adquisición de imagen para cada longitud de onda. Tiempos de adquisición de imagen demasiado largos aumentarán el efecto fototóxico y, en última instancia, conducirán a la detención del crecimiento y a la muerte celular. Por lo tanto, debe lograrse un equilibrio entre la calidad de imagen y la viabilidad celular. - Adquirir imágenes desde múltiples posiciones de las etapas para aumentar el número de células registradas en el mismo experimento.
- Para adquirir imágenes de varias posiciones del escenario, activa Múltiples Posiciones de Escena en la pestaña Principal . Luego haz clic en la pestaña de Escenario y haz clic en el botón Vivir para ver el campo de visión.
- Mueve el escenario en la dirección X/Y hasta que una región de interés (ROI) esté en el campo de visión. Guarda las coordenadas X y Y haciendo clic en el "+" en la pestaña de Etapa . Mueve el escenario de nuevo en la dirección X/Y hasta encontrar un nuevo ROI y guarda las coordenadas de nuevo haciendo clic en el "+". Continúa hasta que se guarde el número deseado de regiones.
NOTA: En caso de adquisición de imágenes por fluorescencia, asegúrate de que las regiones de interés (ROI) no estén demasiado cerca unas de otras para minimizar la fototoxicidad.
- Comprueba una vez más que las celdas estén enfocadas haciendo clic en las diferentes posiciones X y Y guardadas y inicia el enfoque automático por hardware pulsando AFC para mantener la posición Z guardada constante durante el experimento.
- Inicia las grabaciones en time-lapse en el software de control del microscopio haciendo clic en Adquirir en el asistente de Adquisición Multidimensional .
NOTA: Aparecerá una ventana para cada longitud de onda adquirida, y aparecerá una ventana adicional que mostrará el número de puntos de tiempo adquiridos y el tiempo hasta la siguiente adquisición de la imagen. - Comprueba que las celdas sigan enfocadas después de los primeros puntos temporales en las grabaciones en time-lapse para maximizar la calidad de las imágenes y reenfocar si es necesario.