Imágenes en lapso de tiempo de células vivas de la depredación de Bdellovibrio bacteriovorus sobre E. coli

Resumen

Fuente: Makowski, Ł., et al. Imagen de células vivas del ciclo de vida del depredador bacteriano Bdellovibrio bacteriovorus mediante microscopía de fluorescencia en lapso de tiempo. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demuestra imágenes de fluorescencia en lapso de tiempo de Bdellovibrio bacteriovorus que se alimentan de E. coli inmovilizada bajo una almohadilla de agarosa, permitiendo la visualización en tiempo real de la replicación intracelular y la liberación de descendencia para estudiar la depredación bacteriana y las interacciones huésped-patógeno.

Protocolo

1. Conducción de microscopía de fluorescencia en lapso de tiempo

1. Coloque la placa de 35 mm en el soporte de la placa de Petri de modo que no se mueva durante el experimento. Coloque una gota de aceite de inmersión (índice de refracción de 1,518) sobre el objetivo y también sobre el fondo de la antena de 35 mm.
2. Monta el soporte sobre el escenario del microscopio invertido en la cámara del microscopio.
3. Configura las opciones en el software de control del microscopio para recoger múltiples imágenes en distintas posiciones de escenario a lo largo del tiempo.
   1. Ajusta la ampliación (100x) y la lente policromática (GFP (proteína fluorescente verde)/mCherry). Usando un ocular y un campo claro (BF), encuentra el plano focal y abre el gestor de listas de puntos.
   2. Selecciona al menos 10 posiciones de interés moviendo el escenario y almacenando las coordenadas de cada posición en el software del microscopio haciendo clic en el botón de Marcar punto . Evita posiciones muy cercanas para evitar el fotoblanqueamiento y la fototoxicidad. Gira la válvula de la cámara del ocular al monitor y calibra cada punto configurando el plano focal y haciendo clic en el botón Reemplazar punto en el gestor de la lista de puntos.
   3. Abre el diseñador del experimento y establece todos los parámetros experimentales en cada pestaña de la siguiente manera:
      1. Desmarca la caja de apilamiento Z .
      2. Elige canales fluorescentes y establece los ajustes óptimos de iluminación. Aquí se usaron los siguientes ajustes: para el canal mCherry, conjuntos de filtros mCherry (EX575/25; EM625/45), 50% de intensidad y tiempo de exposición de 200 ms; para el canal GFP, conjunto de filtros GFP (EX475/28; EM525/48), 50% de intensidad y 80 ms; y para las imágenes BF, canal POL, intensidad del 5% y 50 ms.
      3. Selecciona los intervalos entre la adquisición de imágenes y el tiempo total del experimento. Aquí, se realizaron intervalos de 5 minutos durante las 10 horas del experimento.
      4. Activa el mantenimiento del foco para las posiciones elegidas (para el sistema usado aquí, marcando la casilla Mantener el foco con UltimateFocus ).
      5. Selecciona la carpeta de datos donde los archivos de imagen deben guardarse automáticamente.
      6. Revisa todos los ajustes en el control del software del microscopio y luego inicia el experimento en time-lapse.
4. Después de la primera hora del experimento, comprueba que todas las posiciones del escenario siguen enfocadas. Ajusta el enfoque durante los intervalos de tiempo entre adquisiciones de imagen, si es necesario.
5. Cuando termine el experimento en time-lapse, se retira la placa de Petri y se utiliza la placa de 35 mm con una almohadilla de agarosa según el protocolo de bioseguridad.
   NOTA: Todos los subpasos posteriores al paso 1.2 son específicos para usuarios de DeltaVision Elite. Los investigadores que utilizan otros sistemas deben ajustar la configuración según cada sistema.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Biología Molecular Certificada Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarosa de baja fluorescencia para almohadilla de agarosa
Fiyi	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Paquete de procesamiento de imágenes de código abierto
Plato inferior de cristal 35 mm	Ibidi	81218-200	Vidrio sin recubrimiento
Microscopio	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, módulo láser de enfoque definitivo, cámara DV Elite CoolSnap HQ2, ensamblaje SSI FP DV, kit obj. Oly 100x aceite 1.4 NA, prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Inicia SoftWoRx	GE		Software de imagen suministrado por el fabricante